Meghatározása az elsődleges szerkezetét a fehérje
Meghatározása elsődleges szerkezetének fehérjék
A primér fehérje szerkezetét kell szolgált egy sor előzetes műveleteket. A fehérje alaposan meg kell tisztítani, a tisztaság a anyagot meg kell erősíteni legalább két független módszerrel. Leggyakrabban ispolzetsya gélelektroforézis poliakrilamid (PAGE) és ultracentrifugálás. Miután a fehérje tisztítását van osztva két vagy három vagy több részből. Mindegyik részt kezeltük különböző enzim u proteinázok (tripszin, kimotripszin) vagy a reagens (bróm-cián, jodozil sav). Az eredmény egy, két vagy három (vagy több) készlet polipeptidek (fehérje szegmens). Proteináz K fermentam- speciális követelmény a tisztaság, a különben nehéz lesz a későbbi-szekvencia meghatározását a váltakozása szegmensek a natív peptidek a fehérje lánc. Különösen nehéz az elismerése helyeit diszulfid-hidak ciszteincsoportok között. A kapott peptid-keveréket elektroforézissel elválasztjuk, majd el lehet kezdeni közvetlenül sevenirovaniya eljárás. peptid önmagában nem haladhatja meg a 40 AK-maradványok.
A leggyakrabban használt módszer a peptid szekvenáló (AA szekvenálás maradékok ott) van P. Edman eljárás. elő fenil-izotiocianát (FITC). Az eljárás alapján automatikus szekvenátorok. tisztított peptid mintát felvisszük a felületre a reakcióedény a film formájában. Gyakran előfordul, hogy a varrás végezzük kovalens peptid szabad végén a COOH csoportok az anyag a reakcióedénybe. Ezután folytatott egy sor ismétlődő ciklusok reakciókat. Egy sor reakciók közé:
- reagáló FITC-terminális AA maradékot, amelynek szabad NH2 -csoport, amely egy ún FT K. (feniltiokarbamoil) származék:
- FITC feleslegét eltávolítjuk, a pH változtatásával hozzáadásával heptafluor-vajsav, ahol konverziós történik FTC PTH (feniltiogidantoin) származék:
- PTH-aminosav-származék eltávolítjuk a reakcióközegből extrakcióval 1-klór-bután és reakciók sorozatát megismételjük a következő ciklusban.
Egy ciklus alatt eltávolítottuk egy aminosav a peptid NH2-szélén. Mivel a reakció FITC nem jár mennyiségileg, és a legjobb 95 százalékkal, fokozatosan felhalmozódnak zavaró tényező N- PTH-származékok nem reagált a korábbi ciklusokban AK maradványok. A legkedvezőbb esetben lehetséges megbízhatóan azonosítani a sorozat csak 40 AK-maradványok. Azonban, mivel a folyamat automatizálása, a munka még mindig sokkal könnyebb.
BONTÁS ÚTJÁN peptidáz:
a) N-terminális maradékok alkalmazásával aminopeptidáz (kromatográfiás azonosítása és kinetikája a felhalmozódása a megfelelő AA.
b) a C-terminális alkalmazásával karboxipeptidázok (hasonlóan).
Hidrazinoli (vízmentes körülmények között 100 ° C-on), kivéve az utolsó maradékot egy szabad COOH, minden átalakul hidrazidok savak:
Az, hogy a peptidek a fehérje molekulák határozzuk meg átfedő peptidjeinek fragmensei:
G-W-V-RA-O-V-KC-E-C-D triptikus peptidek (tripszin)
G-WV-R-A-OV-K-C-E-C-D himotripticheskie peptidek (kimotripszin)
Ajánlott olvasmány:
1. Hozzuk létre EA Biological Chemistry. M. 1986.
2. Strayer L. Biochemistry, 3 Vols. Mir 1984.
3. Fehér, Handler. Smith et al., Biochemistry Fundamentals, 3 Vols. Mir 1981.
4. YA Ovchinnikov Bioorganic Chemistry, M. Education 1987.
5. Anisimov et al., Biochemistry Fundamentals. M. Higher School 1986.