Szekvenálási módszerek DNS-szekvenálás a sanger által, modern szekvenálási módszerek
A szekvenálás a DNS-szekvencia dekódolása.
a) Sanger által végzett szekvenálás;
c) a következő generáció szekvenálása;
d) félvezető szekvencer.
A DNS szekvenálásában használt polimerázok:
a) Klenow fragmentum (E. coli DNS polimeráz), hiányzó exonukleáz aktivitással, amely az 5'-3 irányú DNS-t felosztja. A fragmentum megtartja a polimeráz és a 3'-5 'exonukleáz aktivitást.
b) Rekombináns DNS-polimerázok, amelyek megfelelnek az alábbi követelményeknek: - a 3'- és az 5'-exonukleáz aktivitás hiánya,
- nincs megkülönböztetés a hagyományos és a módosított (jelölt) ddNTP-k növekvő láncolatába való beépítés tekintetében.
c) Termosztatikus polimeráz a szekvenáláshoz:
-Thermo Sequenase ™, Amersham Pharmacia Biotech
- AmpliTaq FS ™, PE Biosystems
Sanger által végzett szekvenálás:
1. "Plus-mínusz" módszer, 1975
Templátként egy polimeráz reakcióban, egyszálú másolat-DNS-fragmenst alkalmaztuk, mint a primer - természetes vagy szintetikus oligonukleotidok szubfragmensét hidrolízisével nyert restrikciós endonukleázokkal, valamint az enzim - Klenow-fragmens DNS-polimeráz I (Poll) az E. coli. Az eljárás két lépést tartalmazott. Először is, a korlátozott körülmények között polimeráz reakciót jelenlétében végezzük mind a négy típusú dNTP (egyikük jelzett az alfa-foszfát pozícióban), így egy sor fragmens hiányos másolást mátrix termékeket. A keveréket megtisztítjuk a nem kötődött dezoxinukleotid-trifoszfátok és nyolc részre oszlik. Ezt követően, a „plusz” rendszer jelenlétében végezzük a négy reakció esetében mind a négy típusú nukleotid, és egy „negatív” rendszer - hiányában mindegyikük. Ennek eredményeként, a „mínusz” rendszer megszűnése előtt történt dNTP ilyen típusú, és a „plusz” rendszer - után. Az így kapott nyolc mintákat elektroforézissel elválasztjuk, „olvasni” jelet, és határozzuk meg a szekvenciáját az eredeti DNS-t. Ily módon a DNS-t szekvenáltuk rövid fág fH174 álló 5386 nukleotid-pár.
2. Terminator módszer, 1977
№22 A molekuláris biológia tudósai
25 éve vezette a Cold Spring Lab-ot, ahol rákkutatási kutatásokat folytatott.
Az 1950-es évek második felében a Creek megpróbálta elméletileg meghatározni a fehérjeszintézis mechanizmusát. 1958-ban felsorolta a fehérjeszintézis folyamatának legfontosabb jellemzőit:
- a genetikai információt DNS-molekulák formájában tárolják
- A mátrix RNS információt tartalmaz egyetlen fehérje létrehozására
- Az adaptív molekulák (adapter molekulák) a mátrix RNS-nek megfeleltetett fragmenseit helyezték el a jövőbeli fehérje aminosavjaival
- A ribonukleotid-fehérje komplexek katalizálja az aminosavak összeszerelését egy fehérjéhez a mátrix RNS szerint
Creek először bevezette a molekuláris biológia "központi dogma" kifejezését (amely ma használatos), hogy bemutassa a genetikai információ egyoldalú átmenetét a mechanizmus által:
DNS -> RNS -> fehérje ("Az információ átadódik a nukleinsavakból a fehérjéhez, de nem az ellenkező irányba").
3. Maurice Wilkins
Fiziológiai és orvostudományi Nobel-díj 1962 (közösen James Watson és Francis Crick) „azok a felfedezések a molekuláris szerkezet nukleinsavak és jelentőségét a információcsere az élő anyag”. Ő tett hozzájárulás területén a tudományos ismeretek foszforeszkáló, izotópszétválasztó, optikai mikroszkópos és röntgendiffrakciós, valamint jobb radar. Maurice Wilkins széles körben ismert a munka meghatározásában a DNS szerkezetét a King 's College, University of London
A tudományos tevékenység fő iránya a nukleinsavak kémiai összetételének és szerkezetének vizsgálata volt. Erwin Chargaff meghatározták a nitrogén bázisok mennyiségi arányát. 1950-től 1953-ig kimutatták, hogy az egyes DNS-molekulákban lévő adenin-maradékok teljes mennyisége megegyezik a timin-maradékok mennyiségével, és a guanin-maradékok mennyisége a citozinmaradványok mennyisége. A Chartaff szabályai a Francis Creek-et és a James Watson-t használták fel a DNS szerkezetének kettős hélixként való meghatározására. Charguff azt is bizonyította, hogy a DNS fajspecifitással rendelkezik, és elutasította a sokféle DNS létezésének hipotézisét. Erwin Chargaff volt az első, aki elkezdte kutatni a DNS-denaturációt. Ezenkívül véralvadást tanulmányozott, tanulmányozta a lipideket és a lipoproteineket, valamint az aminosavak metabolizmusát.
7. Robert Holley,
Holley megosztott Nobel-díjat fiziológiai vagy orvostudományi 1968-ban Khar Gobind kártya és Marshall Nirenberg „értelmezési a genetikai kódot, annak funkciója a fehérjeszintézist
Díjas fiziológiai vagy orvostudományi Nobel 1968-ban (együtt Robert Holley és Khar Gobind Khorana) „az értelmezése a genetikai kód és a funkcióját a fehérjeszintézis”
1960-ban Nirenberg, J. Heinrich Mattei-vel közösen kezdte tanulmányozni a nukleotidokat. Nirenberg és Mattei a baktériumon kívül szintetikus RNS molekulát termelt és E. coliban expresszálta
A módszer magában foglalja a négy összetevőből áll: a szegmens a DNS kettős spirál, az úgynevezett a templát DNS a másolandó, két oligonukleotid primert (Rövid szegmensek egyszálú DNS-t, mindegyik komplementer egyik rövid szekvenciák a templát DNS-t) nukleotidok - kémiai építőelemek, amelyből a DNS-molekula van kialakítva és az enzim polimeráz, amely lemásolja a DNS-templát által ezekhez kapcsolódó szabad nukleotidokat a megfelelő sorrendben.
Ezeket az összetevőket felmelegítik, ami a sablon DNS kettős hélixét külön spirálokká választja. Az elegyet lehűtjük úgy, hogy a primerek a sablon áramkörök szegmenseinek komplementer végeire kötődjenek. Ezután a polimeráz megkezdi a sablonszegmensek másolását oly módon, hogy nukleotidokat kapcsol a láncindítók egyik végéhez, és végül kettős hélix DNS-t termel.
A ciklus megismétlése exponenciálisan növeli a DNS mennyiségét: minden 30 ciklus, amely csak néhány percet vesz igénybe, több mint egymilliárd példányt ad az eredeti DNS-szekvenciának.
1960-ban a Wisconsin-i Egyetemen folytatott enzimkutató intézetbe költözött, ahol oligoribonukleotidok szintézisén dolgozott, akkoriban a legaktívabb kémiai probléma a nukleinsavak területén.
Először kidolgozott egy módszert helyspecifikus mutagenezis a korai 1970-es évek, és tökéletesítette több éve. 1978-ban, Smith és munkatársai elérték az első siker a irányított mutagenezis bakteriofág DNS-molekulák, és 1982-ben képesek voltak előállítani nagy mennyiségű enzim, amely segítségével az ő módszerét helyettesíti bármely kiválasztott aminosav az aminosav-szekvenciája az enzim.
2) RAPD (random amplifikált polimorf DNS; amplifikálható DNS-fragmensek) - Módszer amplifikáció DNS-szegmensek random primerek (körülbelül 10 nukleotid) nem igényel előzetes ismerete a DNS-szekvencia, ám a sztochasztikus természete a DNS amplifikációs fontos optimalizálási és fenntartása megfelelő feltételeket, hogy reprodukálható eredményeket . A módszert használják, például, hogy tanulmányozza a közeli rokonságban álló fajok és molekuláris azonossága növények in vitro szaporítjuk [13, 14, 15]. A hátrányok A módszer: dominancia, nem túl jól reprodukálható, és annak szükségességét, ultratiszta szennyezetlen DNS, mivel a rövid random primerek vezethet, hogy amplifikáljuk a különböző szervezetek; lókusz specifikus markerek és a nem homológ fragmenseket azonos méretű (homoplasy). Hiánya miatt vosproizvodmiosti RAPDs nehéz használni a laboratóriumok közötti vizsgálatok. Mivel a fent említett fontos az eredményeket és azok értelmezését is megkérdőjelezhető.
4) AFLP (amplifikált fragmentum hossz polimorfizmus; amplifikációs polimorf DNS-fragmentumok hossza) - Módszer szelektív PCR amplifikáció polimorfikus fragmentumok hossza, eredő enzimes emésztéssel a genomiális DNS restrikciós endonukleázokkal. A kapott restrikciós fragmensek után a szelektív amplifikáció „varrott” oligonukleotid-adaptereket. Így a primerek állnak az adapter és a nukleotid-szekvencia több (1-5), specifikus restrikciós enzim felismerési. Polimorfizmus fragmenseket hosszúságú (általában néhányszor tíz per reakció) miatt több genomiális restrikciós helyek, feltárt elektroforézissel. A reprodukálhatóság és számos informatív szilánkok reakció módszer alkalmazható különböző aspektusait: a tanulmány a genetikai azonosság, az azonosítását fajtákat és klónokat filogenetikai, térképészeti MAS és más eljárás megvalósítása megköveteli a magas minőségű DNS .. Bár a AFLPs, mint RAPDs, nem igényel előzetes ismereteket a DNS-szekvenciák, az ilyen típusú markerek nehéz használni a tanulmány a különböző populációk vagy fajok. Hátrányai AFLPs domináns allélokat lehetséges homológ egyenlő hosszúságú fragmensek - homoplasy. Abban az esetben, ékelődik szomszédos restrikciós helyek megfigyelhető elvesztése rövid fragmentumok és a megjelenése hosszabb. Ha domináns markerek, mint például a diploidia egy sávban fordul elő azokban az esetekben, ahol az egyik vagy mindkét homológ kromoszómák tartalmazzák az amplifikált szekvenciát, azaz, Nem lehet különbséget tenni a homo- és heterozigóták között. A zavart fokozza poliploiditás, mivel még abban az esetben egy bizonyos sávban még nehezebb megmondani, hogy mennyi az allél jelen van. [22] Mindazonáltal, a használata AFLP markerek az elmúlt évtizedben (PubMed) gyakorlatilag nem csökken. Az alkalmazott módszer a tanulmány az evolúciós és ökológiai szempontok élőlények, miközben a faj.