Rekombináns (kiméra) DNS - Biológia
Read: meghatározása a nukleotid-szekvencia (szekvenálás) DNS
1. A rekombináns (kiméra) DNS
Rekombináns DNS genetikai mérnökök úgynevezett kiméra. Ők hozták létre a különböző célokra, beleértve a célzott HIV fertőzés. Az utóbbi években a számos tanulmány ezen a területen igen nagy. Az egyik vizsgált áramkörök felhasználásával kiméra DNS a következő. Ahhoz, hogy egy proteint kódoló gént receptor CD4. „Hem” egy másik gént, amely biztosítja a szintézisét növényi ricin-A fehérje. A ricin a középkorban használták, mint egy erős méreg. A sejtben, blokkolja a fehérjeszintézist a citoplazmában, és ezáltal megöli. Miután bevitelével a sejtekbe egy rekombináns DNS végső soron a kialakulását egy kiméra általa kódolt fehérje. Az a rész, amely megfelel egy fehérje receptor, biztosítja szigorúan specifikus kötődését a kiméra, hogy a sejtek felszínén, amely tartalmaz egy vírus fehérje CD4. A másik egy ricin toxin, és elpusztítja a sejteket, amelyhez egy kiméra molekula. Így az egyik része a kiméra egy irányított keresési a szervezetben a sejtek vírussal fertőzött, és a többi része megöli őket. A rendszer nagyon egyszerű és hatékony. Mivel a „gyilkos” lehet használni nem csak a gén a ricin, hanem néhány más géneket.
Egy másik megközelítés, hogy a HIV alapul a képesség bizonyos virális proteinek (Tat és Rev), rendkívül fontos a reprodukciós sejtekben a HIV, amelyek specifikusan kötődnek specifikus régióinak a virális RNS-molekulák. Ennek megakadályozására a létfontosságú folyamatot, azt javasolták, hogy vezessenek be a fertőzött sejtek mesterségesen szintetizált RNS kötőhelyeket tartalmazó virális fehérjék. Vírusos fehérjék egyébként, hogy mit lehet kommunikálni - a vírus RNS vagy pontosan ugyanazt a „copy” konstruált art. Adunk a sejt nagy számban, a „másolat” ebben az esetben szerepet tölt be a „csapda”: ha ez sok, egy fehérje a vírus kötődnek elsősorban vele, nem a vírus RNS-t és ennek eredményeként, a HIV megszűnik szaporíthatók.
Elméletileg ezek a megközelítések nagyon vonzó. És, amint azt a vizsgálatot, izolált sejtekben, nagyon jól működik. Azonban nincsenek megbízható módon szállítani, és biztosítja a hosszú működési kiméra „konstrukciókat” az egész szervezetben.
Nemrég arról számoltak be, hogy a teremtés egy másik „kimérák” HIV keresztül antiretrovirális gyógyszerek enfervirtid.
Enfervirtid egy rövid fehérje fragmense gp41 HIV. amely annak ellenére, hogy ez olyan, mint a „natív” vírus megakadályozza „merge” a cellában. Alapján egerek retrovírus épített kiméra-vírus, amely képes a humán sejtek, hogy ilyen rövid részlet a HIV-fehérje és a „stand” a sejtfelszínén fertőzött a kiméra vírussal. Ennek eredményeként, a HIV nem tud belépni sejtek jelenlétében is mind közül receptorok és ko-receptorok. Tehát a virális fehérje fragmens viselkedik, mint egy „pajzs” ellen, a teljes vírus. Nagyon fontos, hogy a védelem aktiválódik egy igen korai szakaszában sejtfertőzéséhez. Elvégre, ha a vírus már behatolt azt, hogy foglalkozzon vele szinte lehetetlen. Lépések a klinikán vizsgálatok az új „kimérák”, a kutatók szerint, hogy az igen biztató eredményeket.
2. Rekombináns DNS-
Alatt érteni rekombináns DNS kombinálásával kialakított in vitro (in vitro) A két vagy több elkülönített DNS-fragmentumokat a különböző biológiai forrásokból. A kulcs ebben a definíció a „DNS-fragmens” és „Association in vitro”, ami azt jelzi, a természet a géntechnológia, és ez eltér az összes többi előállítási módszereinek hibrid (vagy kiméra) organizmusok, mint például a genetikai kiválasztás, embrionális mérnöki, stb
DNS-fragmentumok, beleértve fragmentumokat tartalmazó géneket állítunk elő a restrikciós enzimekkel enzimek. A restrikciós enzimek képezhetnek mind fragmentumok tompa vagy ragadós végek. Térhálósítása DNS által termelt fragmensek három fő módszer, attól függően, melyik a végek térhálósítható DNS-fragmensek.
A térhálósítás az azonos nevű „ragadós” végeket (restrikciós enzim ligáz módszer)
Ez a módszer a leggyakoribb és legnépszerűbb. Ez az első alkalom ezen a módon a hibrid DNS-t kapunk S. Cohen és munkatársai 1973-ban. Néhány restrikciós enzim, mint például PstI, DNS bevezetését szimmetrikus elhelyezve ferdén lánc széttörhető egyenlő távolságra a központtól a felismerési hely és a forma egy „lépés” (lásd. 36.). Ezek a komplementer részek egymáshoz általában összefüggésbe miatt bázispárosodás, és ezért nevezzük őket, vagy komplementer ragadós végekkel. Bázispárosodás történik csak közötti komplementer szekvenciák, úgy AATT végeket kialakítva EcoRI, nem párosodnak, például AGTST-végek által alkotott Hind III. De bármely két fragmens (függetlenül azok származási) alatt képzett azonos restrikciós enzimmel, lehet összeragadnak képződése miatt a hidrogénkötések nukleotidok között a komplementer egyszálú szakaszok (ábra. 39).
Azonban, miután ilyen teljes illeszkedő integritását a kettős spirál helyreáll, hiszen a két megtöri foszfodiészterváz. Annak hasznosítására, azaz a tűzés, ligálással vagy fonalak DNS-ligáz enzimmel. Ez az enzim egy élő sejt ugyanaz a funkciója - térhálósító DNS fragmentumok szintetizált replikáció során.
Térhálósítás „tompa” végek (a csatlakozó módszer)
A ragadós végeket nem feltétlenül szükséges a kötési DNS-fragmentumok. Tompa végeket is csatlakozott hatására DNS-ligázt, ha ligáz, és tompa végeket vannak jelen a reakcióelegyben nagy koncentrációban. Ebben az esetben a ligálási megvannak a saját jellemzői és hatékonysága alacsonyabb, mint a keresztkötések által ragadós végeket. Az első ilyen kísérleteket 1972-ben Paul Berg, Stanford University, USA. A ragadós végek úgy is enzimatikusan kapcsolódik a DNS-molekulák tompa végű. Erre a célra, az enzim - terminális transzferáz borjú-csecsemőmirigyből, hogy tulajdonít nukleotidok az 3 „végén a DNS-láncok. Ha egy 3'-végén az egyik kombináljuk in vitro, DNS fragmentumok terminális dezoxinukleotidil kivitelben egyszálú oligo (dA) -segmenty bizonyos hosszúságú, és a végén a többi fragmentum - oligo (dT) -segmenty megközelítően azonos hosszúságú, majd keverjük össze, így kapunk széttöredezi módon párosodás révén a hidrogén kötések kialakulását az oligo (dA) - és oligo (dT) -sequences (40. ábra). A kovalens kötéssel a két fragmens DNS-ligáz segítségével. Ezek az eljárások képezik az alapját a második általános módszert előállítására rekombináns DNS-molekulák.
Amint képezhetők kellően hosszú vzaimokomplementarnye egyszálú végek, a hibrid molekulák keletkeznek nagy hatékonysággal. Különösen, így amikor DNS-t klónozunk példányban mRNS, amelyek rendelkezésre állnak a korlátozott mennyiségben, általában egy csatlakozó is¬polzuyut módszerrel. Ezzel a módszerrel a kapcsolatot fragmentumok között beágyazott részei AAAA. Ilyen további TTTTT szekvencia működését befolyásolják csatlakoztatott molekulák, és ezért, amikor csak lehetséges, és így kapjuk a rekombináns DNS-molekulák ragadós végeket kialakítva, mint eredményeként a restrikciós enzimek.
A térhálósító fragmensek ragadós végekkel szemben
Olyan helyzetekben, amikor azt szeretnénk, hogy öltés a töredékek amelyet különböző restrikciós enzimekkel, és különböző, azaz nem egymással komplementer ragadós végek használt úgynevezett kapcsolókat (vagy „adapter”). Linkerek - kémiailag szintetizált oligonukleotidokat képviselő restrikciós helyek, vagy ezek kombinációja. Ez az első alkalom ez az ötlet által javasolt Scheller és munkatársai 1977-ben.
Vannak nagy gyűjtemények ilyen gén „adapterek”. Természetesen akkor, ha a kapcsolókat kell figyelembe venni annak szükségességét, hogy tartsák tiszteletben a szabályokat a genetikai információ kifejeződése. Gyakran a közepén a kapcsoló, hogy egy genetikai szabályozó elem, például egy promoter vagy kapcsolódó webhely helytől. Ebben az esetben a kapcsolókat nem csak a szakszervezeti gének, de okozhat annak expresszióját. Van kapcsolókat „tompa végű - ragadós vég.”
Ha szükséges, a ragadós végeket lehet alakítani tompa. Ezt úgy érjük el, hasítása a ragadós végeket egy enzimmel - az S1 endonukleáz, amely tönkreteszi az egyetlen egyszálú DNS-vagy ragadós végek „épül”, azaz a DNS-polimeráz I szintetizálására egyszálú kohézív végei a második szál.
Read: meghatározása a nukleotid-szekvencia (szekvenálás) DNS
Információ a munkáját „rekombináns (kiméra) DNS”
A készlet a kapcsolt gének egy kromoszóma szabályozására allogruppu nevezett haplotípus. Jelentése: 1) a tanulmány a okait és dinamikáját genotípusos változékonyság alapján evolúciós genetika; 2) tisztázása az egyes állati eredetű; 3) meghatározása mono- és kétpetéjű ikrek; 4) az építési genetikai térképét kromoszómák; 5) használata biokémiai rendszerekben a genetikai.
vektorokat expressziós. 2.2 Módszerek a közvetlen bevezetése a génnek a sejt közvetlen bevezetése a gént a sejtben végezzük több módon: 1. Transzfekció 2. mikroinjektálása 3. Az elektroporációt 4. Módszer „mini-sejt” 5. csomag liposzómákba elektronágyú 6. DNS-transzfekció adszorbeált kalcium-foszfát kristályok (Graham Van der Eb.