Mikropreparátumok festése
Mikropreparátumok festése
A mikrobiológiában használt festékek többsége benzolszármazékokhoz tartozik, és kivonják a kőszénkátrányból.
A mikrobiológiában használt színezékek kétféle sók: 1) savas színezékek azok, amelyekben a színező ion (kromofor) egy anion (eozin szolgálhat példaként); 2) a fő színezékek azok, amelyekben a kromofór szerepét a kation játssza (metilén kék szolgálhat példaként).
Az első típusú színezékek savasak, mivel a kromofor, amely egy sav, a színező anyag előállítása során a bázishoz (NaOH) kötődik.
A második típusú színezékeket bázikusnak nevezzük, mivel a kromofór, amely a bázis, kötődik a sav (HCl) /
A savas színezékek általában a sejt citoplazmatikus (bázikus) komponenseivel, és a főbbek - nukleáris (savas) is kötődnek.
Egyes festékek hatása nem függ a sók vagy egyéb kémiai vegyületek képződésétől a festett anyaggal. Egyszerűen fedik le a felületet, adszorbeálják, feloldják vagy kicsapják az anyagot.
A festés folyamatában mind a fizikai, mind a kémiai tényezők szerepet játszanak
Egyszerű és összetett módszerek mikroszkópos készítmények festésére.
Egyszerű színező módszerek
Egyszerű módszer a mikropreparátumok festésére, a leggyakoribb anilin színezékeket használják. Nagyon széles körben használatosak a metilkék, az alapvető bíbor, a kristályos ibolya, a tionin.
Egyszerű festőmódszert alkalmazhatunk mind a mikrobiális sejtek meggyilkolására, mind a mikroorganizmusok élettartama során.
Az intravitális színezést csak úgy kell megfontolni, hogy a színezett organizmusok életben maradjanak, és sokáig képesek reprodukálni. Az intravital festés számos módszere létezik, köztük a Nakanischi módszer.
Ezzel a módszerrel egy átlátszó üveglapot átöntünk telített vizes metilénkék-oldattal, megszárítjuk és száraz ruhával töröljük, amíg a festék bevonat világos kék színű. A fedőüvegen a vizsgálandó mikrobákból kenetet készítünk, majd a végtelenítésig nem száradt hatóanyagot festékkel ellátott csúszólemezre helyezzük. Mikroszkóp segítségével megfigyelheted, hogy a mikrobák miközben életben maradnak, anélkül, hogy elveszítenék az aktív mobilitást (ha vannak ilyenek), fokozatosan kék színűvé válnak.
Ez a módszer értékes abban az értelemben, hogy amikor alkalmazásra kerül, nem áll fenn a mesterséges feldolgozó termékek kialakításának veszélye a mikrobiális sejtek bizonyos funkcionális jellemzőinek feltárásának lehetőségével.
Az egyszerű színező módszerek közül mind a pozitív, mind a negatív festési módok léteznek.
Az egyszerű pozitív módszerek a színezésre a színezés a Lleffler módszer szerint, és a negatív festés Buri módszerével.
A Leffler (Loffler) módszerrel végzett festéshez alkalmazhatunk metilén kék (Leffler festék) oldatot, amely lehetővé teszi a mikroorganizmusok alakjának és szerkezetének számos részletét. A Leffler-festék két A és B oldat elegye.
A. oldat: metilkék - 0,3 g, etil-alkohol - 30,0 ml.
B. oldat: KOH (0,01%) - 100 ml.
A keveréket jól megőrzött üveg injekciós üvegben, üveges dugóval.
Ahhoz, hogy több tiszta készítményei, festék lehet önteni egy szűrőpapíron bevont kenet, vagy használhat előre impregnált szűrőpapírt színezéket és szárítjuk. Ebben az esetben, a rögzített kenet szuperponált szalag krasilelem száraz impregnált szűrőpapírt, majd alkalmazzák a papír pipettázunk több desztillált vizet, és egy spatulával vagy csipesz van nyomva az üveg szűrőpapíron. A festéket lemostam a papírról és megfestették a kenetet. Festés után idő, a szűrőpapírt eltávolítjuk, a kábítószer-ben mostuk gyengén folyó vízzel mossuk, szárítjuk és mikroskopiruyut.
Egy megfelelően színezett és jól mosott készítményben a látómező világos és tiszta marad, és csak a mikrobás sejtek lesznek színezve.
A pozitív színezési módokon kívül bizonyos esetekben negatív (kontrasztos) módszereket is alkalmaznak. Ebben az esetben a mikroorganizmusok, amelyekben a színezék nem hatol be, úgy néznek ki, mint a könnyű részecskék egy egyenletesen színezett háttéren.
A mikroprocesszorok negatív festésének nagyon gyakran folyékony fekete tintát ("negatív" Burri) használnak.
A Storm módszerével a készítmény hátterét folyékony szempillaspirálba öntik. A szempillaspirál nem egy igazi festék, így a mikrobák testei nem festenek; ami negatív képet eredményez róluk.
Ebben a módszerben a szempillaspirálist vízzel 1: 9, 1: 1 vagy 1: 2 arányban hígítjuk.
Mivel a szempillaspirál magában tartalmazhat baktériumokat, néhány csepp formalin hozzáadásával vagy 110 ° C-on 30 percig autoklávozható. Használat előtt az elkészített szempillaspirál (hígított és steril) két-három hétig nyugodt állapotban maradjon, így a benne lévő részecskék rendeződnek. A szempillaspirál készítmények előkészítésekor a feloldott folyadék felső részét alkalmazzuk.
Egy csepp fekete hasított testet helyezünk egy csúszkára, és alaposan összekeverjük egy csepp mikrobiális szuszpenzióval. A keveréket egy vékony réteggel összekeverjük a csúszó felületén a fedőüveg szélén. Amikor a sötét réteg megszárad, a hatóanyagot rögzítik és mikroszkóppal vizsgálják. A mikrobiális sejtek színtelen testek formájában és a készítmény sötét hátterében láthatók.
Szintén folyadék szempillafesték, hogy a negatív festést alkalmazhatjuk vizes oldatok kongorot (3% 0, Nigrosine (10%) és néhány más festéssel negatív színezékek végezhető két módon: vagy a színezék oldatot felvisszük egy száraz, rögzített kenet, vízzel való mosás után, és a szárítás mikroskopirovat ;. egy csepp a baktérium szuszpenziót összekeverjük festék és borított fedőlemezt mikroskopiruyut. és valójában, mindkét esetben a mikrobiális sejteket színtelen.
A színezés komplex módszerei
Egy egyszerű módszer a pozitív vagy negatív festéses módszerrel mikroorganizmusok nagyon alkalmas a különböző célokra (a tanulmány a alakját és elhelyezkedését a sejtek, a méretre, detektálás kapszulák a mikrobiális sejtek kenetek - lenyomatai szerveiben való fertőzött szervezet, és így tovább.).
Azonban, egy egyszerű módszert festés nem tud különbséget mikroorganizmusok (beleértve a baktériumokat) hasonló alakú és méretű, de tartozó különböző fajok, egy egyszerű módszert festés nem tudja érzékelni érett spórákat és ciszták, ömlött ki a sejtek a környezetben, egy egyszerű módszert festés nem teszi lehetővé Érzékelje a sejteket összetett szerkezettel, stb.
Emiatt a komplex színezési módszerek nagy értéket képviselnek, lehetővé téve az ember számára, hogy nemcsak a sejtek egymáshoz viszonyított alakját, méretét, elhelyezkedését, a mikrobák megkülönböztetését és a mikrobiális sejtek strukturális részleteit határozza meg.
Közülük az egyik kifinomultabb módszereket színértékét folyamatát ábrázolja festésére dán tudósok fejlesztettek Gram lehetővé mikroorganizmusok különbséget két nagy csoportra úgynevezett „Gram-pozitív” és „Gram-negatív”, ami nagy érték, hogy azonosítsák a mikroorganizmusok.
Ezt a színezést különbözõ színezõnek nevezik. A mikrobák gramm szerinti differenciálódásának alapja a sejtmembrán és a citoplazmatikus membrán tulajdonsága.
Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusok sejtfalának alapja a peptidoglikán. Gram-pozitív mikrobáknak a peptidoglikánnak több rétege van, gram-negatív mikrobákban egyrétegű.
Gram-pozitív baktériumok, egy sűrű és többrétegű peptidoglikán, a komplex képződik, amikor kristályibolyával festettük és ezt követő megmunkálása a jódoldat nem alkohollal mossuk, és a sejtek nem elszíneződött, és megtartják a lila szín. Míg a gram-negatív mikrobák, amelyeknek vékony peptidoglikán rétege van, elszíneződnek az alkohollal. További bíbor szín vagy sapraninom Gram-negatív sejteket festjük sirenevato - piros.
A színeződést megőrző mikroorganizmusokat "Gram-pozitívnak" nevezik, és "G +" jelzéssel ellátva, színtelenítve - "Gram-negatív" és "G-" jelzéssel.
Gram-pozitív és gram-negatív mikroorganizmusok differenciálódásának indikátorai:
Gram-pozitív mikroorganizmusok nem érzékenyek a gyomornedv hatására, nincs komplex szerkezetük. Lizozimmel, penicillinnel és jóddal szemben ellenálló lúgoktól. Az immunogén tulajdonságok gyengén expresszálódnak, az optimális növekedés viszonylag magas pH-n. Egy élő állapotban az elektrolitokra érzékeny színezékek sokkal áteresztőbbek. Ezek savasak lehetnek és spórákat képezhetnek. Ezek többrétegű peptidoglikánok, és teichoic-savakat tartalmazhatnak. A sejtfal porózus, kevés fehérjét tartalmaz, a peptidek monotonok az aminosavak összetételében. A lipidek kevés, sok glikoprotein (99%).
A Gram-negatív mikroorganizmusok a legtöbb esetben feloldódnak a gyomornedv hatása alatt, oldódnak fel 1% -os KOH-oldatban, érzékenyek a savakra. Alacsony érzékenység lizozimra, penicillinre, jódra. Az immunogén tulajdonságok jól kimutathatók. Optimális növekedés a táptalaj alacsony pH-értékénél. Egy élő állapotban gyengén áteresztőek az anilin színezékekhez. Ellenáll a gyenge elektrolitoknak, nem keletkeznek spórák. A sejtfal alapja egyrétegű peptidoglikán, a teikovasav hiányzik. A sejtfal alacsony porózus, összetett szerkezetű, valamennyi aminosavat tartalmaz. A lipidek sokak (legfeljebb 22%), kevés a glikoprotein (5-9%).
Megoldások a Gramm módszer szerinti színezésre:
1. A) oldat - kristályos ibolyaszínű - 2,0 g, etilalkohol 95% - 20,0 ml.
2. B oldat - ammónium-oxalát 0,8 g, desztillált víz - 80,0 ml.
Az A oldatot desztillált vízzel (1: 5) hígítjuk, majd azonos térfogatú B. oldattal összekeverjük.
3. Lugol oldata - kristályos jód - 1 g, kálium-jodid - 2,5 g, desztillált víz - 80,0 ml. Ezt a keveréket 24 órán keresztül hagyjuk jód feloldására.
4. További festés - sapranin vagy magenta (2,5% -os oldat 95% -ban alkoholban) - 25 ml. Desztillált víz - 75 ml.
A Gram módszer szerint színező módszer:
1. Helyezzen egy kenet mikrobiális sejteket, foltot gentianviolettel (2 perc).
2. Vegye le a gentian ibolyát, majd alkalmazza Lugol oldatot (2 perc) a készítményhez.
3. Óvatosan öntsük le Lugol oldattal és mossuk készítmény 95% -os etil-alkoholt (. 30 másodperc sejteket színes többrétegű peptidoglikán maradnak genciánibolya, egyetlen réteg peptidoglikán - elszíneződött).
4. Óvatosan öblítse le vízzel.
5. A foltot fchsin vagy sapranin (1-2 perc) oldattal foltoljuk.
6. Óvatosan öblítsük fel a készítményt vízfolyással, szárítsuk levegőn szobahőmérsékleten vagy meleg égő láng feletti meleg levegőáramban, vagy óvatosan szűrjük le a szűrőpapírral.
7. Tanulmányozza a hatóanyagot mikroszkóppal.
A színezékek komplex differenciáldiagnosztikai módszerei szintén a Ziehl-Naelsen módszer szerinti színezők, amelyek lehetővé teszik a savgyors mikroorganizmusok azon tulajdonságait, amelyek nem rendelkeznek ezzel a tulajdonsággal.
A mycoprotein Tsil-Nielsen szerint történő előkészítését és színezését a következőképpen végezzük:
1. A vizsgálati anyagból (páciens köpet vagy tiszta kultúra) a szokásos módon készítsen egy fix kenetet.
2. Helyezzen be egy szűrőpapírt egy rögzített kenetre, és töltsön rá egy karbolos fuchsin oldatot rá. A tárgyüveget a Korne-csipeszbe rögzítjük, és az előkészítést 4 percig melegítjük az égő lángja fölött (ahogy a folyadék elpárolog, hozzáadjuk a festékoldatot).
3. 4 perc elteltével (a melegítés befejeződése után) a szűrőpapírt finoman eltávolítjuk a készítményből, és a kenetre 30 percig 95% etil-alkohollal készített 5-10% -os kénsav vagy sósavoldatot adunk.
4. 30 másodperc elteltével a készítményt óvatosan hideg vízsugárral mossuk, majd metilén kékkel oldva festjük.
A mechanizmus a sav-festés mikroorganizmusok által Ziehl - Neelsen következőképpen magyarázható: melegítés közben a viasz előállítására, egy része a héj meglágyul, és ezáltal a festék behatol a bakteriális sejt. Hűtés, ez a viasz megtartja a festéket, így alkohol, savval, a festéket csak olyan sejtekről öblítse ki, amelyek nem rendelkeznek savállósággal. A metilénkék további színezésével elszíneződött sejtek festenek, és ezen a kék háttéren jól láthatóvá válnak a vörös színű, savtartalmú baktériumok.
Festékek festéshez Tsil-Nielsen szerint:
1. A) oldat - foszfát alapanyag - 0,3 g, etilalkohol 95% - 10,0 ml.
2. B oldat - fenol (olvadt kristályok) - 5,0 g, desztillált víz - 95 ml.
3. A Leffler vagy a gyémánt zöld metil-kék oldata.
Az A és B oldatokat összekeverjük (karbolikus fuzin). A keverék jól megőrzött.
A gyakorlatban, ha tanul mikroszkopikus stroke - nyomatok szerv, vér kenetek, a tanulmány a spirochéták, egysejtűek, chlamydia, a szövettenyészeteket széles körben használják másik bonyolult festési eljárás - foltot Romanovsky - Giemsa.
A festés módja Romanovsky - Giemsa szerint:
1. A hatóanyagot szárítjuk, rögzítjük egy folyékony rögzítőbe (metanol 3 - 5 perc).
2. A készítményt megszárítjuk és a festék munkaoldatához egy csészébe helyezzük (az expozíció 20-25 perc 37oC-on, a festékoldat koncentrációját és az expozíciót titrálni kell). A festett kenetet etil-alkohollal (50-60 fok) differenciáljuk, vízzel óvatosan öblítjük, szárítjuk és mikroszkóposan átmossuk.
A Romanovsky - Giemsa szerint festett színezőanyagok oldatai:
1. A. változat Az oldatot - 3,8 g száraz festéket, amely eozin és metilénkék keverékéből áll, feloldva 250 ml tiszta metil- vagy etil-alkoholban. Az oldatot több napig hagyjuk, gyakran rázva a festék jobb feloldásához. Ezután adjunk hozzá 250 ml tiszta glicerint, és hagyjuk 3-5 percig rázni. A kapott megoldás - a festmény Romanovsky - Giemsa.
Felhasználás előtt a festéket 1: 1, 1: 2, 1: 3, stb. Hígításokban titrálják. desztillált vízben 20-25 percig.
2. Opció B. Alkalmazza az azur-eozin színét.
a) 1 g száraz festéket Romanovsky - Giemsa (azur és metilénkék) feloldunk egy liter desztillált vízben.
b) 1 g eozint feloldunk egy liter desztillált vízben.
Ez a két megoldás külön tárolva sötét helyen, üvegedényekben, földelt üvegdugókkal.
Az ex tempore készítmények színezésére elkészül egy munkaoldat:
10 ml desztillált vizet
4 ml eozin oldatot
8 ml Romanovsky festékoldat
A készítmények jó színének előfeltétele a víz minősége (a víz pH-ja semleges).