Restrikciós hely
Restrikciós hely. Restrikciós enzimmel. VNTR-polimorfizmus.
A restrikciós fragmensek hosszának polimorfizmusa (RFLP) az elsők között volt. Az a tény, hogy az ilyen restrikciós enzimek (restrikciós enzim) és hogyan működnek fejezetében vannak leírva 7. Minden restrikciós enzimet elvágja a DNS-molekula felismerő specifikus nukleotid szekvenciához, hogy ez, amely az úgynevezett egy restrikciós helyet.
Ha a restrikciós helyre mutáció lép fel, függetlenül attól, hogy hol helyezkedik el, és a nukleotidok szekvenciája megváltozik, akkor a restrikciós enzim nem ismeri fel egy ilyen módosított helyet, és nem vágja le a DNS-molekulát ezen a helyen. Ugyanakkor a restrikciós enzim továbbra is csökkenti a szomszédos változatlan restrikciós helyeket.
Ennek eredményeképpen a mutáns DNS egyik restrikciós fragmense hosszabb, mint a nem mutáns DNS megfelelő fragmensei. A polimorf restrikciós hely jelenlétének detektálása a DNS-ben, restrikciós enzimmel végzett emésztés után, elektroforézisnek vetik alá.
Az elektroforézis során a DNS-fragmenseket molekulatömegük szerint osztják szét. Jellemzően a genomiális DNS restrikciója után több százezer fragmens képződik. Ezek a fragmensek denaturáltak, azaz azokat egyetlen jegyzetekké alakítják át, azokat egy nitrocellulóz-szűrőre visszük át, amellyel szorosan kötődnek. Emlékezzünk arra, hogy ezt az eljárást Southern blottingnak nevezzük.
Mivel néhány restrikciós enzim elég gyakran vágja le a DNS-t, a polimorfizmus keresésére különböző radioaktív foszforral jelölt DNS-próbákkal hajthatók végre. Ezek lehetnek gének vagy más DNS-szekvenciák szekvenciái, amelyek helyét ismerjük.
Így gének mutációi kimutathatók, ha ezek a mutációk megváltoztatják bizonyos restrikciós enzimek restrikciós helyét. Jelenleg több száz korlátozás ismert, amelyek felismerik a különböző nukleotidszekvenciákat. A kutatók rendelkezésére áll több ezer DNS-próbát a genom különböző részeire.
Ezeknek a képességeknek a használata több ezer polimorf helyet azonosítottak az emberi genomban. A legtöbb esetben a RFLP dvuhallelnuyu rendszer (jelenlétében vagy távollétében egy restrikciós hely), azonban magas frekvenciájú ilyen polimorfizmusok sikeresen a térképezésben használt számos gén örökletes betegségek, beleértve mukovistsi-dózis, neurofibromatózis 1. típusú, és még sokan mások.
Jelentősen nagyobb számú allél és így nagyobb genetikai sokféleség, valamint információérték egy másik típusú DNS polimorfizmusban, amelyet változó számú tandem ismétlésnek vagy VNTR polimorfizmusnak nevezünk.
Az emberi genomban előforduló különböző típusú DNS-ek leírását említjük a miniszatellit ismétléssel. Ezek az ismétlődések szétszóródnak a genomban, fő szekvenciájuk akár 80 nukleotidot is tartalmazhat, és a fő szekvencia ismétlődéseinek száma nagymértékben változhat.
Megkezdődik a VNTR polimorfizmus kimutatása, valamint az RFLP kimutatása, a genomiális DNS restrikciós enzimmel történő megkötése, a fragmens elektroforézise, denaturálása és a Southern-féle blotolás. A különbség abban a tényben rejlik, hogy a hibridizációhoz egy adott miniszatellit-ismétléshez specifikus DNS-próbákat alkalmaznak.