A DNS-technológiát az orvostudományban
A molekuláris biológia jelentősen befolyásolta a modern orvostudomány: ezek nem csak elmélyítette a megértése a sok betegség okát képezik, hanem hozzájárultak az új megközelítések a diagnózis és a kezelés.
Detektálásához hibák a szerkezet a DNS meg kell izolált biológiai anyagok és az „másolt” (halmozott) elegendő mennyiségben a vizsgálathoz. Mert génterápiás működik szükséges elkülönítése normális gének és azok bevezetése a hibás sejteket, hogy azok kifejezése, amely lehetővé teszi, hogy állítsa vissza a beteg egészségét.
DNS izolálása magában foglalja a gyors sejtlízis, deléciós fragmenseket és membránok a sejtalkotók centrifugálással, pusztulástól proteázok a fehérjék, DNS extrahálás, majd annak kicsapódását. A kiválasztás során nagyon nagy molekulák, ezek tovább daraboltuk restrikciós enzimek segítségével. Az így létrejövő fragmentumokat elektroforézissel elkülönítjük. Száma és hossza a kapott fragmentumokat, és ennek megfelelően, a helyét a sávok a electrophoregram egyedi és különleges, hogy minden egyes ember.
Azonosítása specifikus szekvenciák végezzük Southern-blot Southern hibridizációval. A DNS-fragmenseket vetettük alá denaturálási és szállítására transzfer (blotting) egy sűrű közegben (szűrő vagy membrán). DNS rögzítve a szűrőt hibridizáljuk kis fragmensekből a DNS vagy RNS, amely egy radioaktív (vagy fluoreszcens al.) Mark. Az ilyen fragmensek nevezzük DNS- vagy RNS-próbák. Mintákat komplementer szekvenciákat a próbaként, a hibridizációs meghatározható vizuálisan vagy útján speciális eszközök. A módszert használják diagnosztizálására fertőző betegségek, genetikai hibák, létrehozó expressziója bizonyos gének.
Szekvenálása (meghatározása az elsődleges szerkezet) a DNS-t úgy végezzük, hogy kémiai vagy enzimatikus módszerrel. Maskama és Gilbert módszerrel (kémiai) alapuló kémiai lebomlását DNS. A módszer lényege a következő: az egyik végén a DNS-fragmens jelölt radioaktív vagy fluoreszcens jelölővel. A készítmény jelzett DNS négy részre osztjuk, és mindegyik kezeljük egy reagenst, amely lebontó egy vagy két, a négy bázis, és a reakció feltételeit úgy választjuk meg, hogy minden egyes molekula DNS volt néhány hibák. Az eredmény egy sor jelzett fragmensek, amelyeknek hossza határozza meg a távolságot az alapja elpusztult vége előtt a molekula. A fragmens alakult mind a négy reakció elektroforézisnek vetjük alá négy szomszédos sávokra; akkor töltik azonosítása. A helyzet az ujjlenyomat meg tudja határozni, hogy milyen távolságra a jelzett végén a bázis elpusztult, és tudván, hogy alapot - álláspontját. Tehát egy sor sávok határozzák a DNS nukleotidszekvenciája.
Sanger módszerrel (enzimatikus) modellezése alapján a DNS-polimeráz reakció, ahol a DNS-molekula vizsgálat alatt használjuk templátként. A reakcióelegyhez hozzáadtunk didezoxinukleotidok (OH csoport 3'-helyzetében a pentóz offline). DNS polimeráz a prekurzorok a DNS-be. Azonban, tartalmazza a DNS-t, a módosított nukleotid nem alkotnak foszfodiészter-kötést az alábbi dezoxiribonukleotid. Ennek eredményeként, nyúlása a lánc megáll azon a ponton, ahol csatlakozott a DNS didezoksiribonukleotid. A reakciót végrehajthatjuk egyidejűleg négy különálló csövek, amelyek mindegyike egy négy didezoxinukleotidok és minden 4 dezoxinukleotid trifoszfát (ez általában kapcsolódnak, egy radioaktív vagy fluoreszcens jelölés). Az egyes csövek kialakított egy sor jelzett fragmensek különböző hosszúságú. A hossza függ, ahol a vonalkapcsolt hibás nukleotid. A kapott jelzett DNS fragmenteket egy poliakrilamidgélen, hogy belül egy nukleotid azonosítása végzik, és az elosztó fragmensek mintája a sor négy mintát DNS nukleotidszekvencia.
Előállítása rekombináns DNS és amplifikáció. A készítmény a rekombináns DNS-molekulák izolált két különböző forrásból. Mindegyik töredezett külön ugyanazt a restrikciós enzimmel. A beavatkozás után, a fűtési és lassan kapott keveréket hűtjük fragmenseket, valamint az eredeti DNS-molekulákat és rekombináns termelt álló DNS-szegmensek tartozó különböző eredeti mintákat. Rekombináns DNS technikákat, lehetővé válik, hogy vizsgálja variációk felelős gének fejlesztése sok betegség. különböző mutációt azonosítani lehet ezen a módon.
Ahhoz, hogy jelentős mennyiségű rekombináns DNS genetikai anyag hajtjuk klónozás, ami arra utal, beillesztése a kívánt DNS-fragmenst egy vektorba molekulát, vektort penetráció biztosítja a rekombináns DNS-t bakteriális sejtekben. Amikor szaporító a transzformált baktériumokat egy kópiaszáma megnő a bejuttatott DNS-fragmens, és a szintézis a bakteriális sejt nem inherens, de nagyon értékes a humán protein termékek. Ily módon, a vakcinák, inzulin, növekedési hormon, véralvadási faktorok, és mások.
Munka nukleotidszekvenciák igényel elegendő anyagot vizsgálatok. Ezért, pre-amplifikált DNS-fragmenseket (növekedés összege). Módszer polimeráz láncreakció (PCR) javasolt 1983 Curry g. Mullis, ez lehetővé teszi specifikus amplifikációs alá in vitro körülmények között bármely DNS-mintákat.
Polimeráz láncreakció zajlik három szakaszból áll:
1. dást.
Az inkubációs keverék, amely tartalmazza a DNS-minta hőmérsékletre melegítjük 90 ° C-on Így 15 másodpercig a megsemmisítése gyenge hidrogénkötések között DNS-szálak, és az egyik a kettős-szálú molekula képződik két egyszálú.
2. hibridizációja a primerek.
Az elegy hőmérsékletét 50 ° C-on Van tehát hibridizációs DNS-szálak primerekkel. Ez a szakasz általában körülbelül 30 másodpercig tart.
3. Polimerizációs.
Az inkubációs elegyet 70 ° C-on Ezen a hőmérsékleten, mind polimeráz meghosszabbítja a primert a 3'-végeket. Primereket növekszik a méret a mátrix. Ez a folyamat akkor 90 másodpercen belül. Ennek eredményeként, a DNS mennyisége megduplázódik.
Az eljárás automatikusan végrehajtásra kerül az egység - a thermal cycler (tsiklizatore, thermocycler). A készülék lehetővé teszi, hogy állítsa be a kívánt ciklusok számát, és válassza ki az optimális idő és hőmérséklet paramétereket. PCR kaphat elegendő számú másolata a DNS, ami arra utal, a mutációk jelenlétét, polimorfizmusok helyek, végezhetjük DNS diagnózis fertőzés betegeknél virális, bakteriális és gombás kórokozók.
Kapcsolódó hírek: