A mozgatható és a stacionárius fázis, az ionos csoportok - ioncserélő kromatográfia
Ami a lehetőségeket igaz kromatográfia célszerű bevezetni a „mobil” és a „helyhez kötött” fázisban. Ez arra utal, hogy a mozgás a frakcionált molekulák le az oszlop. Mozgófázis, természetesen, molekulákat tartalmaznak kívül granulátumok. Mozognak a jelenlegi az használunk. Állófázis - molekulák a granulák belsejében. Egy ilyen szétválás megtörtént, és a gélszűréssel. Vannak még ebben az értelemben molekulák voltak miatt oldódás egy helyhez kötött víz közegben betöltjük a granulákat. Persze, ebben a környezetben, tették Brown-mozgás, de nem helyezheti át őket a hangszórók. A anyag granulátum magukat, ha reagáltatjuk őket, majd mechanikusan - találkozik polimer szálak, kialakítva a szemcséket.
Abban az esetben, ioncserélő kromatográfia, ellenkezőleg, a stacionárius fázis elsősorban molekulákat tartalmaznak specifikus módon kapcsolódó anyagot pellet ( „szorbeált” rajta). A porozitása az utóbbi ebben az esetben úgy választjuk meg, hogy a frakcionált molekulák szinte szabadon behatolnak granulátumok, kitöltve a teljes belső térfogata.
A nagyon neve ioncserélő kromatográfia azt jelzi, hogy a kapcsolat a molekulák granulátum ionos. Ezt úgy határozzuk meg, Coulomb erők közötti vonzás ionok ellenkező előjelű, csatlakozik a szálak és a granulátumok molekulák meglévő a felületen. A „fix” és a „létező” azt sugallják idők és rögzített helyzet örökre. Eközben a rugalmasság és hatékonyság a módszer ioncserélő kromatográfia támaszkodik csak a lehetőségét szabályozó a helyzetet, és vele együtt az áramcsatlakozó frakcionáljuk molekuláris anyag mátrix granulátum - szorpciós jellege ezen molekulák.
Ahelyett, hogy állandó ion a szálak a mátrix és a felszínen a makromolekula (pl, fehérje) található „ionos csoport”, amely, a körülményektől függően a környező vizes közegben (pH =, sók jelenlétében) manifesztálódhat, akár nyitott, csapágy elektromos töltés ionok, vagy semlegesítjük miatt konvergenciája ezek ellentétes töltéssel ionok, mint például Na + és a C1-, és néha miatt rögzítési vagy disszociációját, protonok H +.
A felszínen a ionogén csoportok fehérjék oldalsó ágak végződő aminosavak, például lizin vagy arginin, és az aszparaginsav és a glutaminsav. proton disszociációs az első esetben, és a második egyesülési semlegesíteni ezeket a csoportokat. Mindkét folyamat koncentrációjától függ a protonok a környező vizes közegben, azaz. E. A pH-érték (vagy lúgos vagy savas régió). Ahelyett, hogy a kémiai módosítások azok, amelyek mindkét jelenség, a semlegesítése ionos töltés csoportok is előfordulhatnak miatt adaptációja ellentétes töltésű ion, célszerűen az intézkedés a Coulomb-erő ellen az ionos csoportot a környezetet. A kovalens kémiai kötés alakul ki. Screening ion ebben az esetben az úgynevezett „ellenionok”.
Ionos csoportokat képesek mutatni a pozitív töltés, a továbbiakban: „anioncserélő” - ők valamilyen módon hasonló az anód egy elektromos áramkört. Csoport megnyitja negatív töltés, illetve a továbbiakban: „kationcserélők.” Módosításához kromatográfiás granulátumok szálak kiválasztott gyakorlatban kis számú ionos csoportok különböző „erők”. A leggyakrabban használt a „anioncserélő” (kromatográfiás mátrix csapágy anion) a következők: dietilén Noetus - rövidítése DEAE és di-2-etil-oksipropilaminoetil rövidítése QAE. Megjegyezzük, hogy az első ilyen csoportok viszonylag könnyen kémiailag semlegesített lúgos környezetben miatt egy proton elvesztése. Második - hordoz pozitív töltést bármilyen pH környezetre és az adaptációs semlegesíteni lehet csak negatív töltésű ion. Ennek megfelelően különbséget bázisú anioncserélő DEAE nevezik „gyenge”, és hőcserélők alapján QAE - „erős”.
Hasonlóképpen, abban az esetben a negatív ionos csoportok „kationcserélők” a „gyenge” - ők a karboxi-metil-csoportok, és a „erős”, amelyek módosított szulfopropil-csoportok. Rövidítések E csoportok, illetve SM és az SP. Erős kationcserélők megtartja negatív töltés az egész működési tartományban a biológiai értékek (PNZ - 11), és csak akkor lehet átvizsgálni pozitív ellenionok.
Ami a mátrixok, hordozók ismertetett módosítást (abban az esetben, frakcionálásával biopolimerek), az már ismert, hogy számunkra a pellet alapú poliszacharidok: Sephadex kémiailag térhálósított agaróz és cellulóz. Kereskedelmi nevük vannak jelen, és a neve a mátrixanyag és rövid jelzése az ionos csoportok. Például: .. „DEAESephadex», «QAE-cellulóz»«CM-Sephadex», «SPSepharose CL» stb Minden típusú többféle hőcserélők különböző pórusméretek és granulátumok.
Mátrix az ioncserélő kromatográfia, nagy nyomáson (szilikagél) I kívül hagyják. Pharmacia Company annak rendszer gyors fehérje kromatográfiás kifejlesztett kizárólag egységes méretű szemcsék Kétféle erős ioncserélők: anioncserélőt márkanéven „Mono P” - aktív csoport trimetilaminometil kationoobmenik és „Mono S» - sulfometil aktív csoport.
Most hasznos lesz elképzelni néhány térbeli kapcsolatokat. Mi fog összpontosítani a tisztítási és frakcionált fehérjék, mivel ez - a fő alkalmazási területe ioncserélő kromatográfia. Az átmérők globuláris fehérjék (szemben a tömegük) nem változhat jelentősen. Például, egy olyan molekula, a szarvasmarha szérum albumin (M = 69,000) az átmérője 70 A, és a gamma-globulin-molekula (M = 150,000) mintegy 100 A. (Tekintettel ezek a számok I említettük polisztirol-alapú mátrix, mivel felbontású ezután, abban rejlik, hogy a 5-20 a)
A porozitás a mátrixok frakcionálására alkalmaztak fehérjék közötti tartományban a 300-1000 A. Ilyen pórusok fehérjemolekulák mozoghatnak olyan szabadon, mint egy teniszlabda készült dróthálót borda térbeli sejtek 30-40 cm.
A fehérjéket a felszínen ionos csoportok lehetnek vagy aláírja aminosavat (az összes - gyenge), egymástól bizonyos távolságra a parttól több tíz angström. Ionos csoportokat a granulák belsejében lehet elhelyezve szorosabban miatt csatlakozott az OH-csoportok lehet végezni minden egyes egység a glükóz. De hiába, mert a két olyan szorosan egymáshoz csoportok nem, méretük miatt kommunikálni egyszerre két fehérjemolekula, és a veszteséges, mint tele túl erősen kötődik egy molekula több ponton. Gyakorlat kifejlesztette az közötti átlagos távolság ionos csoportokat egyetlen mátrix mérete a 10--30 A.