A virális vektorok (génterápia)
A virális vektorok [idézet]
Sajátosságai miatt az első vektor (transzgén szolgáló) életciklusának vírusok génterápiás kezdett kialakulni ez alapján rájuk. Vírusok transzferált idegen gének, amelyek azután kifejezve a fertőzött sejtekben. Leegyszerűsítve a vírus jelen lehet nukleinsav, csomagolva egy héj. A vírus belép a célsejtbe, ahol a kifejezés a virális genom. Ahhoz, hogy hozzon létre egy jó vektort kell változtatni bizonyos tulajdonságait a vírus. A legtöbb esetben a vírus meg kell tagadni a lehetőséget, hogy reprodukálja, hogy megakadályozzák a ellenőrizetlen elterjedése a transzgén. Szintén része a virális genom kell távolítani, hogy legyen hely az idegen genetikai anyag. Egyéb szükséges változtatásokat függ a vírus típusától. A virális vektorok széles körben használják a pre-klinikai vizsgálatokban, és jelenleg is velük tölteni a legtöbb klinikai vizsgálatokban.
A retrovírusok [idézet]
Ezek a kis RNS-tartalmú vírusok fertőzik csak az osztódó sejteket, amelyben azokat reprodukálni. A virális genom (mint provírus) integrált DNS-ébe a célsejtben. Ezért, a retrovirális vektorok, elméletileg képes a hosszú távú transzgén expressziójának bizonyos sejttípusokban. A legtöbb retrovírus vektorok alapján kapott Moloney egér leukémia vírus. A vírus genomja módosítjuk, hogy megakadályozzuk expresszióját virális fehérjék a fertőzött sejtekben, amely megakadályozza fejlesztése elleni immunválasz ezeket a sejteket. Mivel ezek a vírusok csak az osztódó sejteket, retrovirális vektorok elsősorban azok az ex vivo sejtek transzdukcióját (lásd. Alább), vagy a kísérleti rosszindulatú daganatok kezelésére szolgáló.
Az életciklus. A retrovírus genom RNS-ből áll, plusz szál. A héjat a retrovírussal fertőzött sejt membránok és tartalmaz virális fehérjéket. A replikációhoz és összeszerelése a genom vírusok szükséges három virális gének - gag, pol és env. A fertőzött sejtekben egy reverz transzkripciós virális RNS a mátrix képződik kettős szálú DNS-t (a provírus), amelyet azután beépül a sejt genomjába. Ez biztosítja a virális fehérjék - reverz transzkriptáz és integráz. Ahhoz, hogy behatoljanak a sejtmagba provirális szükséges nukleáris megsemmisítése a sejtmembrán fordul elő, hogy a mitózis során. Beépített a sejt genomjába provírus sejteket használ virusnyhmRNK berendezés transzkripció, transzláció és feldolgozását. Vírus életciklusának befejeződött a szintézis az új plusz-RNS láncok a mátrixban provírus. A specifikus szekvencia az RNS-molekula (psi) jel lehetővé teszi a szerelvény, amely után az új vírusok bud a sejt felszínén.
5.1 ábra. A retrovírusvektorok alkalmazásának. A. reakcióvázlat megszerzésének egy retrovirális vektor.
Megjelenés és a vektor. A retrovirális vektorok előállíthatók a megfelelő provírus. Genes gag, pol és env eltávolítjuk, hogy helyet csináljanak az új genetikai anyag, és megakadályozzák a vírus replikációját (ábra. 5.1). A retrovirális vektor lehet építeni akár 8000 pár idegen DNS nukleotid. Mivel a rekombináns vírus nem képes szintetizálni vírus mRNS transzfektált sejtekben nincs jelen, és a vírusfehérjék szintézisét, amelyek immunválaszt okoznak. Génnel együtt kezelésére, beléphet a vektor promoter és enhan-Ser biztosítva a hatékony transzgén expresszióját, és bizonyos esetekben a szövet jellegét. Az is lehetséges, hogy egy virális promotert és enhanszert található a hosszú terminális ismétlődő (LTR).
Leírás 5.1 ábra. A retrovírusvektorok alkalmazásának. A. reakcióvázlat megszerzésének egy retrovirális vektor. A nem képesek reprodukciós retrovirális vektorok speciális sejtvonalakban szintézisére képes vírusfehérjék akiknek gének deletáltak, amikor A vektor. Egy alkalmas sejtvonal (például, humán embrionális vesesejtek) bakteriális plazmidokat bevitt gének gag (G), pol (P) és env (E). A sejteket szintetizáló a megfelelő virális fehérjék úgynevezett csomagolás. Ezután egy olyan plazmidot tartalmazó rekombináns DNS-provírus, amely ahelyett, hogy gének gag, pol és env kívánt transzgént, használjuk transzdukálására csomagoló sejtben. sejtek már tartalmaz mindent, amire szükség van, hogy össze vírusok és retrovírusvektorokat kezdenek felhalmozódni a táptalaj. Ezek a vektorok tartalmazzák a transzgén, de hiányoznak a virális gének gag, pol és env, és ezért nem lehet reprodukálni a következő fertőzés után a sejteket. B. expressziója egy transzgén egy célsejtben bevezetése után az RNS-tartalmú retrovírus vektort (lásd. „Életciklus”).
Biztonság. Mivel a vírus beépül a sejt genomjába (ami fontos a hosszú távú expresszió), és véletlenszerűen, fennáll a veszélye a mutáció (INCERA Zion mutagenezis). Például, beágyazása a vírus megváltoztathatja a funkciója a gén, amely szabályozza a sejtosztódást, ami a nem kívánt következményeket. Képesek a reprodukciós retrovírusok néhány rákkeltő, de ez nem figyelhető meg a retrovirális vektorok hiányzik ez a képesség.
Lentivírusok [idézet]
Használata lentivírusvektorok szinte nem okoznak gyulladást vagy más jelét szövetkárosodást.
Az adenovírusok [idézet]
Adenovírus vektorok nyújtanak hatékony transzdukcióját mind osztódó, mind nem osztódó sejteket, majd transzgének expressziójára. Használhatja a különböző adagolási módok, mint például a I / O, intraperitoneális, intravezikális, intratekális, és injekció a epevezeték, vagy közvetlenül a parenchima a szerv. A különböző beadási lehetővé teszi, hogy válassza ki a legjobb a kijelölt célt. Az adenovírus vektorok két nagy hátránya. Először is, nincs beágyazva a sejt DNS-ébe, így nincs hosszan tartó transzgén expresszióját a virális genom fertőzés után a sejteket. Másodszor, az adenovirális fertőzés aktiválja mind celluláris, mind humorális immunitás összeomlásához vezet a transzfektált sejtek, valamint csökkenti a hatékonyságát ismételt beadása a vektor. Mellékhatások adenovirusvektorok is megmagyarázza az immunválaszt.
Ábra 5.2. A használata adenovírus-vektor.
Mivel az E1 gének adenovírusok résztvevő reprodukciós, blokkoló azok eltávolítására, vagy legalábbis jelentős mértékben hátráltatja reprodukció. Mivel a komplex szerkezete a vírus a vektor eltávolít minden adenovirális gének nehezebb, mint a retrovírus. Szintézise adenovirális fehérjék fertőzés után a sejtek adenovirális vektorok aktiválja meglévő celluláris és humorális immunitást. Bizonyos esetekben ez korlátozza a használatát a vektor transzfektált sejtek elvesztése miatt és az alacsony hatékonyság újbóli bevezetése a vektor.
Leírás 5.2 ábra. A használata adenovírus-vektor. Rekombináns adenovírus specifikus receptorokhoz kötődik a megcélzott sejt felszínén, és behatol át endocitózis. Virális fehérjéket biztosít kimeneti vírust az endoszóma lizoszómájához való találkozásánál; miatt ez a vírus kiszabadul pusztulástól. Adenovírus DNS szabadul fehérjék és behatol a sejtmagba, ahol kezdődik a szintézis az új mRNS. Így adenovirális DNS, amely a transzgén nem genomjába integrálódott a gazdasejt.
Adenovirális vektorok nagy mennyiségben kapott megfertőzése egy csomagoló sejt (jellemzően egy humán embrionális vese sejtvonal 293) expresszáló virális E1 fehérjét, amely kompenzálja a hiánya a megfelelő gén a rekombináns vírus. Ezt követően a fertőzött sejteket lizáljuk, és a lizátumot centrifugáltuk egy sűrűség gradiens cézium-klorid. Ez a módszer lehetővé teszi, hogy ne csak a tiszta a vírusok más sejttenyészet komponensek, hanem, hogy összpontosítson ez, amelynek több mint 10 ^ 13 vírusokat 1 ml. A tisztított vírus nagyon stabil a különböző pufferoldatokat, és a hosszú távú tárolás lehet fagyasztani az aktivitás elvesztése nélkül.
Alkalmazás. Jelenleg sok végzett klinikai vizsgálatok, amelyekben adenovirális vektorokat használunk kezelésére mind örökletes és szerzett betegség. A kezelést az örökletes betegségek legnagyobb hátránya, hogy a rövid időtartama transzgén expressziójának és az immunválaszt, hogy a fertőzött sejtben. Extrachromosomal lokalizációs adenovirális genom a sejtben korlátozza időtartamát transzgén expressziójának aktívan osztódó sejtek (például csontvelő sejtek vagy epitélium), mivel a sejtosztódás nem kíséri replikálódó transzgén. Az adenovírus vektorok képesek és szaporodásra képtelenné, alkalmazhatók lehetnek rosszindulatú betegségek kezelésében (lásd. Alább).
Alkalmazás. Adeno-asszociált vektorokat kezdte használni a klinikán: már a klinikai vizsgálatok során a gén szállítás a tüdő és a vázizmok. Úgy tűnik, ezek a vektorok alkalmasak a hosszú távú transzgén expresszió a vázizomzatban, a szívben, a központi idegrendszer, és egyéb szövetek. Az első eredmények egy klinikai vizsgálat, amelyben keresztül adenoasszociált vektor hajtjuk IX-es faktor gént szállítás vázizom a hemofiliások, sikeresek voltak (lásd. Alább). Az a képesség, hogy ezeket a vektorokat biztosítanak hosszan tartó transzgén expresszióját, anélkül, hogy toxikus hatását a sejtekre, és nem okoz immunválaszt, így ígéretes eszköz a kezelésére bizonyos örökletes betegségek.