Az alkalmazott vektorok géntechnológia
Nagyon kényelmes és sokoldalú, mint lehetséges vektorok a célzott gén szállítás a szövetek és sejtek a szervezet
A géntechnológia a biotechnológia, mint módszer
A géntechnológia - biotechnológia olyan technika, amely már
tanulmányok a szerkezetátalakítási genotípusok. A genotípus nem csak egy mechanikus összege gének, hanem komplex, kialakult az evolúció során
rendszerek a szervezetben. A géntechnológia lehetővé teszi műveletek in vitro át a genetikai információ egyik szervezetből a másikba. Géntranszfert lehetővé teszi, hogy legyőzzék az akadályokat, és a fajok közötti átadása egyes öröklődő tulajdonságok más élőlényekre.
Viselők anyag alapjait gének kromoszómán, tagjai DNS és fehérje. De a gének nem a kialakulását a kémiai és funkcionális. Egy funkcionális szempontból DNS sokaságából áll, a blokkok, tárolására egy bizonyos mennyiségű információt - gének. Az alapja a gén cselekvési, hogy képes felismerni az RNS a protein-szintézist. A DNS-molekula, mintha rögzített azonosító információt a kémiai szerkezetét fehérjemolekulák. Gén - olyan DNS-molekula-rész, amely információt primer szerkezetével egyetlen fehérje (egy gén - egy fehérje). Mivel a mikroorganizmusok jelen vannak több tízezer fehérjék, vannak több tízezer gének. A készlet valamennyi sejt genom gének. Minden sejt, a szervezet tartalmazzák ugyanazokat a géneket, de mindegyik végre egy másik részét a tárolt információt. Ezért, például, idegsejtek és szerkezetileg funkcionális és biológiai tulajdonságai különböznek a májsejtekben.
A szerkezetátalakítás a genotípusok feladatok génmanipuláció
Ez jelenti a minőségi változások a gén nem látható mikroszkóp szerkezete megváltozik a kromoszómák. Változások gének elsősorban a kémiai szerkezetét DNS átalakulás. Információ fehérje szerkezet rögzített formájában egy nukleotid szekvencia van megvalósítva aminosavak szekvenciája a szintetizált fehérje molekula. Változások a nukleotid szekvencia a kromoszomális DNS-t, és a veszteség a néhány más befogadás készítmény nukleotid változást előidéző DNS RNS-molekula, és ez viszont, okoz egy új aminosav szekvencia a szintézis. Ennek eredményeként, a sejtek elkezdenek szintetizálja az új fehérjét, ami a megjelenését egy szervezet új tulajdonságok. ÖSSZEFOGLALÁS génsebészeti technikák, hogy a genotípus a szervezet vannak beágyazva, vagy kizárják az egyes gének vagy géncsoportok. Ennek eredményeként a integrálása a genotípusát korábban hiányzó gén okozhat sejtek szintetizálnak fehérjék, amelyek korábban nem volt szintetizáltuk. [1]
A leggyakoribb módszer az a módszer, a géntechnológia
rekombináns, azaz idegen géneket tartalmazó plazmidok. A plazmidok cirkuláris kettős szálú DNS-molekula, amely több kilobázis. Ez a folyamat több szintből áll.
1. Korlátozás - vágás a DNS-t, például egy személy a töredékek.
2. ligálás - csoport, azzal a génnel közé tartoznak a plazmidok, és ligáltuk őket.
3. Az átalakítási dióhéj rekombináns plazmidok bakteriális sejtekben.
A transzformált baktériumokat így szert bizonyos tulajdonságait. Mind a transzformált baktériumok szaporodik és formák gyarmata sok ezer leszármazottai - egy klón.
4. Screening - a transzformált bakteriális klón közül plazmidokat hordozó gént az emberi.
Ez az egész folyamat a klónozás. klónozása
akkor még több mint egy millió példányban minden fragmentum az emberi DNS-t vagy
egy másik organizmusban. Ha a klónozott fragmentum olyan fehérjét kódol, amely
kísérletek mechanizmusának tanulmányozására, amely szabályozza a gén transzkripciós és a fehérje felhalmozódik a megfelelő mennyiségben. Ezen túlmenően,
klónozott DNS-fragmens egyik szervezetből egy másik, akkor adjuk meg a szervezet sejtjei. Ezt úgy lehet elérni, például a magas és stabil hozamokat miatt bevitt gén rezisztenciát biztosít számos betegség. Ha belépsz a genotípus talaj baktériumok, a gének más baktériumok, amelyek képesek rögzíteni a légköri nitrogént, a talaj baktériumok lefordítani ezt a talajban levő nitrogén nitrogén kötésű. Bemutatjuk a genotípusa a baktérium Escherichia coli gént egy humán genotípusú ellenőrző inzulin-szintézis, tudósok tettek az inzulin termelése révén egy ilyen Escherichia coli. A további fejlődés a tudomány lehetséges lesz, hogy bemutassuk géneknek az emberi embrió hiányzó, elkerülve ezzel a genetikai betegségek. [2]
Kísérletek az állati klónozás végzett sokáig. Elég, hogy távolítsa el a tojást nucleus implantátum ő más sejtmagban vett magzati szövet, és a nő azt - in vitro vagy az anyaméhben
nevelőanyja. Részvények klónozott birka jött létre, nem hagyományos módon. A mag a tőgy cella 6 éves felnőtt birka, egy fajta átültetett egy nukleáris fegyverektől mentes tojás juh másik fajta. A fejlődő embrió került egy harmadik juh fajták. Mivel született bárány van az összes gén az első juh - donor, hogy ez a pontos genetikai másolata. Ez a kísérlet nyit sok új lehetőséget klónozására elit fajták helyett a hosszú távú kiválasztása.
University of Texas tudósok képesek voltak meghosszabbítja az életet többféle emberi sejtekben. Jellemzően a sejt elpusztul, miután átesett körülbelül 7-10 hasadási folyamatok és azok száz sejtosztódás. Aging, a tudósok szerint már annak a ténynek köszönhető, hogy a sejtek az egyes körzetekben a telomerek elveszítik molekuláris szerkezet, amelynek területén található a kromoszómák végéhez. A tudósok ültetik a nyitott sejtek a gén felelős a termelés telomeráz, és ezzel tette őket halhatatlanná. Talán ez a jövőben utat halhatatlanság.
Amióta a 80-as évek megjelent tanulmány az emberi genom programban. az
2. Módszerek, amelyek használják a géntechnológia
A génsebészeti módszereket használnak a szekvenciát, ahol több szakaszban a teljesítménye egy tipikus géntechnológiai kísérlet klónozását célzó bármely gén, nevezetesen:
1. DNS izolálása a sejtekből a kérdéses szervezet (forrás), és izoláljuk a vektor DNS-t.
2. Vágási (restrikciós) DNS forrás mikroorganizmus számára fragmenseket tartalmazó gének, segítségével az egyik enzimek restrikciós enzimek és ilyen gének izolálásának a kapott keveréket a korlátozás. Ezzel egyidejűleg vágjuk (restriktsiiruyut) vektor DNS-t, átalakítja azt a körkörös lineáris szerkezetek.
3. lezárása a DNS szegmens (gén) a DNS-vektort, hogy a hibrid DNS-molekulákat.
4. bevezetése hibrid DNS-molekulák által átalakítása bármely más szervezet, például, E. coli-ban, vagy a szomatikus sejtek.
5. Vetés baktériumok injektált hibrid DNS-molekulák táptalajon, hogy lehetővé tegye a növekedés csak a sejtek tartalmazó hibrid DNS-molekulák.
6. Azonosítás telepek álló baktériumok tartalmazó hibrid DNS-molekulák.
7. izolálása klónozott DNS (klónozott gén) és annak jellemzésére, beleértve szekvenálása bázisok egy klónozott DNS-fragmens.
DNS-t (forrás és a vektor), enzimek, olyan sejtek, amelyekben klónozott DNS - az összes nevezik „eszközök” a géntechnológia.
3. Genetikai vektorok
A „vektor” kifejezés olyan nukleinsav-molekula, amely képes bevezetése után egy sejtbe, hogy autonóm létezését jelenléte miatt abban a replikáció és transzkripció jeleket.
Vektor molekulát kell a következő tulajdonságokkal:
1) a képesség, hogy autonóm módon replikálódni klstke recipiens, hogy az, hogy legyen egy független replikon;
2) egy vagy több markergént, expressziós akin keresztül a recipiens sejtek, úgy tűnik új jellemzők, amelyek megkülönböztetik a transzformált sejteket az eredeti;
3) egy, illetve legfeljebb két része (a helyszínen) különböző restrikciós enzimekkel különböző területeken (beleértve a marker géneket a készítményben), de nem a régió felelős a replikáció.
Attól függően, hogy a kísérleti célok vektorokat lehet két csoportra oszthatók: 1) használt klónozására és a gén amplifikációja; 2) Speciális használt idegen gének kifejeződését ágyazva. A vektorok második csoportját, egyesíti a vektorok, hogy biztosítsák fehérje szintézisét termékek a klónozott gének. Vektorok expressziós DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek szükségesek a transzkripció klónozott másolatainak gének és fordítása mRNS-eik a sejt-törzsek. [4]
Az itt használt prokarióta plazmidvektorok, bakteriofágok; eukarióta vektorok alkalmazott állati vírusok és növényi alapú vektorok és az élesztő 2 mikronos mitokondriumok és számát mesterségesen manipulált vektorokkal képes replikálódni a bakteriális, vagy eukarióta sejtekben (shuttle vektorok).
Plazmid - egy extrakromoszómális genetikai elemek a pro- és eukarióták, amelyek autonóm módon replikálódni a sejtekben. A legtöbb plazmid vektor származik természetes plazmidok ColE1, pMB1 és p15A.
Bakteriális plazmidok vannak osztva két osztály. Az egyik plazmid (például egy jól tanulmányozott F faktor, amely meghatározza a padló által E. coli) képesek mozogni sejtről sejtre, míg mások nem rendelkeznek ilyen képessége. A különböző okok miatt, elsősorban ellenőrizetlen elterjedését gátló potenciálisan veszélyes genetikai anyag, a legtöbb bakteriális plazmid vektorok alapján létrehozott, a másodosztályú plazmidok. Sok természetes plazmidok Már géneket tartalmaznak, amelyek meghatározzák sejt antibiotikum-rezisztencia (termékek ezen gének - módosító enzimek, vagy hasító antibiotikus anyag). Ezen túlmenően, ezek a plazmidok az építési további vektorok kerülnek bevezetésre rezisztenciát meghatározó géneket más antibiotikumok. [5]
Ábra. Az 1. ábra az egyik leggyakoribb plazmid vektorokat E. coli - pBR322. Úgy tervezték alapján részletesen tanulmányozták E.coli plazmid - kolitsinogennogo tényező ColE1 - és tartalmaz egy replikációs origót a plazmid. Feature ColE1 plazmid (és a pBR322, sorrendben) megfelelő, hogy a jelenléte a fehérje-szintézis-inhibitor antibiotikumot kloramfenikolt (közvetetten gátolja a replikációját a gazdasejt kromoszómájába) sorszáma E. coli növekszik 20-50 1000-molekulák sejtenkénti, hogy nagy mennyiségben termeli a klónozott gént. Tervezésekor a pBR322 plazmid az eredeti azt ruházták számos „extra” a restrikciós enzimek.
1. ábra A részletes restrikciós térképét pBR322 plazmid.
Jelenleg, valamint számos olyan kényelmi vektor rendszerek E.coli plazmid tervezett vektorok egy sor más Gram-negatív baktériumok (beleértve az olyan kereskedelmileg fontos, mint a Pseudomonas, Rhizobium és Azotobacter), Gram-pozitív baktériumok (Bacillus), gombákat (élesztő) és a növények .
Plazmid vektorok klónozására alkalmas fragmensek viszonylag kis (legfeljebb 10 ezer. Bp) genomok kis méretek. Ha arra van szükség, hogy megkapja klonoteku (vagy könyvtár) a gének magasabb rendű növények és állatok, a teljes hossza a genom, amely óriási, a hagyományos plazmid vektorokat alkalmas erre a célra. A probléma létrehozásának génbankok a magasabb rendű eukarióták megoldott használva, mint a származékok bakteriofág klónozó vektorok l.
Között a fág vektorok legkényelmesebb rendszert hoztak létre alapján a genomok M13 bakteriofág és l E. coli. DNS-t a fágok tartalmaz kiterjedt területeket is át lehet ruházni vagy ki kell cserélni idegen DNS anélkül, hogy képesek szaporodni E. coli sejteket. Amikor létrehozunk egy család alapú vektorok l fág DNS ezekből az első (hadosztályok rövid DNS-régiók) vettünk sok restrikciós helyek a régió nem esszenciális DNS-replikáció, és megmaradnak a terület található a területen szánt idegen DNS inzertálására. Ebben ugyanazon a területen gyakran behelyezve marker géneket, amelyek megkülönböztetik a rekombináns DNS-t az eredeti vektor. Az ilyen vektorok széles körben használják, hogy készítsen egy „génkönyvtár”. Mérete a helyettesítő fragmens és a fág DNS-t, illetve beágyazott idegen DNS rész határolt 15-17.000. Nukleotid már phago rekombináns gént, amely 10% -kal több vagy 75% -kal kisebb, mint a vad-l fág genomba, akkor nem lehet fágba részecskék. [6]
Ezek a korlátozások nem léteznek elmélet a vektort alapján fonalas bakteriofág M13. Vannak olyan esetek, amikor a genomban az fágot beillesztett idegen DNS hossza mintegy 40 ezer. Nukleotid. Köztudott azonban, hogy az M13 fág instabillá válik, ha egy idegen DNS hosszabb 5000. Nukleotid. Tény, származó vektorok M13 fág DNS, főleg a szekvenálás és mutagenezis a gének és a méretek a benne beágyazott sokkal kisebb fragmensek.
Ezeket a vektorokat a felépítve replekativnoy (kétszálú) DNS formájában M13 fág, amelyet integrált „polilinker” részek (például ilyen szerkezet ábrán látható. 2). A fág DNS-t a részecskék formájában tartalmaz odnotyazhevoy molekulát. Így ez a vektor lehetővé teszi, hogy megkapjuk a klónozott gént vagy annak fragmensét a kettős szálú és odnotyazhevoy formában. Odnotyazhevye formában rekombináns DNS-technikák széles körben használják jelenleg meghatározásában DNS nukleotidszekvenciát a Sanger-féle a oligodezoxinukleotid-irányított mutagenezis gének.
Transzfer az idegen gének állati sejtekben felhasználásával származó vektorok DNS számos jól jellemzett állati vírusok - SV40, néhány adenovírusok, szarvasmarha papilloma vírus, himlő vírus, és így tovább. Ezeket a vektorokat úgy hajtjuk végre, a standard eljárás: eltávolítja az „extra” restrikciós endonukleázok számára, bevezetése marker gének a DNS-régió nem esszenciális a vírus replikációja (például a gént timidin-kináz (tk) a HSV (herpes simplex vírus)), a bevezetése szabályozó régiók, növeli a génexpresszió szintjét.
Kényelmes volt az úgynevezett „ingázó vektorok”, amely lehet reprodukálni az állati sejtekben és baktérium sejtekben. Ezeket úgy állítjuk elő, varrás együtt nagy szegmenseit állati és bakteriális vektorok (például, SV40-ből és pBR322) úgy, hogy a felelős régiók a replikáció a DNS ép maradt. Ez lehetővé teszi az alap működését az építkezés a vektor egy bakteriális sejt (ami technikailag sokkal könnyebb), majd az így kapott rekombináns DNS-t alkalmazzuk gének klónozásához egy állati sejtben. [7]
2. ábra: restrikciós térképe a vektor M13 mp8.
4. Készítsen egy kellően kényelmes és sokoldalú, mint lehetséges vektorok a gén célsejtekbe bejuttatni és szövetek
Fontos szempont, ha építési DNS-vakcinák a probléma a megcélzott gén a sejtekbe és a megkívánt védelmi bevitt DNS-re nukleázoktól vért. Ennek eredményeként a kísérleti munka hoztak létre a különböző minták, lehetővé téve, hogy célzott gének célzott sejtekben.
Az egyik ilyen minták a modell a molekuláris vektor gének bejuttatására a sejteket, például limfocitákat és keratinociták. A modellt használták, mint gént fúziós fehérjét kódoló: nekrózis faktor-alfa tumor - interferon-gamma. A központban a vektor egy intakt plazmid DNS a gént tartalmazó szállított, és a felületen elrendezett az antitest a célsejtekhez. Poliglyukina a spermidin konjugátum és antitest összekapcsolására alkalmazott komponensek (pozitív töltésű spermidin rendelkezik a kötéshez a konjugátum a plazmid DNS-t). Részletesebben leírva lehetővé teszi molekulájú vektor gének bejuttatására célsejtekbe, így minimalizálva azok behatolását más sejttípusok, gének szállítják védve nukleázokkal, és használja a vér pozitív töltésű komplex spermidin polyglukin mint penetrációs promoter DNS sejtekbe.
Ez most is létre a vektor modell a szállítási csontvelősejtek kódoló gént humán granulocita kolónia stimuláló faktor (CSF-Cs). Ez a fehérje családjába tartozik a hemopoetikus növekedési faktorok, és az egyik a fiziológiai szabályozók, specifikusan és igen hatékonyan stimulálják a proliferációját és differenciálódását a hematopoietikus progenitor neutrofilek. Cs-CSF növeli az élettartamát csontvelő sejtek, fokozza a funkcionális aktivitását érett neutrofilek. Alkotó vektor egy többrétegű szerkezet. „Központi mag” konstrukció plazmid pGGF8, amely PY-CSF-gén. Ez körülveszi a poliszacharid héj, amely polyglucin és spermidin. A külső fehérje réteg keverékét tartalmazza szérum albumin és a fehérje célba juttatását - transzferrin. Hatékonyság vektor-leírt modell bizonyult empirikusan.
1. Gren E. Ya Pumpe P. rekombináns virális kapszidot - egy új generációs immunogén proteinek és vakcinák // Journal of WMO. - 1988 - T II, №5 .. - a. 531-536.
2. Dmitriev BA problémái és kilátásai létrehozására irányuló szintetikus vakcinák // immunológia. - 1986. - №1. - a. 24-29.
4. Holt NP Beklemishev AB Savic IM modern megközelítések tervezésének molekuláris vakcinák. - Novosibirsk: Nauka, 1987, 210 o.
7. Shchelkunov SN Gének klónozása. - Novosibirsk: Nauka, 1986, 232 p.