vírus termesztési technikák - studopediya
növekedési faktorok. A sejtek rendkívül érzékenyek a változás-niju pH. A pH-szabályozás adunk a megjelenítő közegen történő megjelenítésére. A legtöbb sejtben. tenyészeteket, mint egyrétegű (Plas-on, amely egy egyrétegű sejtek), szilárdan kapcsolódik a felszínre a tartály termesztésére - csövek, műanyag lemez vagy matrac) (injekciós üveg 4-oldalú mi VOR). Bizonyos típusú sejtek szaporodásra képes díszíte-Sion.
Előkészítő Általános kultty sejteket tartalmaz nem sok egymást követő szakaszban: aprítás a szövet, csatlakozó-Union sejtek tripspozitsii mosására kapott homogén szuszpenziót izolált sejtek tripszin, majd szuszpendáljuk sejtek olyan tápközegben, amely a növekedést (például 199-tápközegben borjúszérum) . Amikor ülepítő a sejtek inkább szilárdan kapcsolódik a falon a csövek vagy palackok, amelyek osztják egy egyrétegű. Megszerzése után életképes tenyészet egyrétegű sejteket fertőztünk a MATE-rials tartalmazó vírusok. UPR említett mikrobák-behatolnak a sejtekbe, ahol megsokszorozódik, azok. Sejttenyészetekben sikerül ápolni legtöbb okozó vírusok az emberi betegség.
Az intracelluláris paraziták dei citopátiás hatás (CPE) a sejtekre, ami előfordul szaporodásukat. CPE megnyilvánulhat megsemmisülése (lízis) a fertőzött sejtek, változások a morfológiai (megváltoztatni a mérete és alakja a sejt, a megjelenése vacuolumok és zárványok, hogy képviselje intracellulárisan felhalmozott vírusok képezik oschtsitiya) és sérti azok funkcióit.
Csirke embriók. Csirke embriók képest sejttenyészetekben sokkal kevésbé szennyezett a vírusok, és szintén összehasonlító magas, de a vitalitás és ellenáll a különböző hatások. Ezek alkalmasak bizonyos vírusok, amelyek a kórokozó az emberre.
Ahhoz, hogy tiszta tenyészeteket Rickettsia, Chlamydia és számos vírus diagnosztikai célokra is. továbbá előállítására különböző készítmények (vakcinák, Diagnostica) ispol'uet, képeznek 8-12 napos csirke embrió. A hátrányok danno th technikát tartalmazzák a képtelenség, hogy észleli a teszt-mikroorganizmus nélkül előzetes boncolás az embrió, és a jelenléte nagyszámú fehérjék és más betétek csatlakoztatva nehezítő ezt követő tisztítását szer a gyártás különböző preparátor
Megfertőzni csirkeembrió vizsgálati anyagot vezetünk be a allantois és amnion üregek-chorion allantois membrán vagy a szikzacskója egy csirkeembrió (ábra.). A fertőzés a allantoisüregébe a héj alatt a levegő cella (határai előtti obvo DYT ceruzát Lámpázás tojás), nem-nem nagy nyílás ollóval, szikével vagy spe-ügyi fúrót. Egy fecskendőpumpa használatával injektált 0,1-0,2 ml vírus-tartalmú anyag, hogy a mélysége 2-3 mm-rel a határ szellős-sósav kamrában. A lyuk a héj van töltve olvasztott paraffinnal. Boncolás fertőzött embriókat termelt szempontjából a maximális felhalmozódása a vírus (48-72 h in-kubatsii 37 ° C-on). A kezelés után az alkohol és a 2% -os oldat jód héj boncolt ollóval kis mértékben meghaladja vázolt sósav ceruza-légkamra határok, dönthető a tojást úgy, hogy ne essen az üregbe a héj. Shell dobni, óvatosan távolítsuk el a hüvelyéből és tekintve-oldott chorio-allantois héj körül a fertőzés helyén, a-mechaya jelenléte vagy hiánya elváltozások -. Vérzés, plakkok, stb Ezután Pasteur-pipettával Pierce chorio-allantois héj területén szabadon vérerek és az allantois folyadékot leszívtuk. Ezt követően visszanyert ho Rion-allantois membrán, akkor kétszer mossuk Isotone-cal nátrium-klorid oldattal, helyezünk egy Petri-csészébe, és vegye figyelembe a fekete háttér jelenlétében specifikus léziók.
Laboratóriumi állatok. Faj fogékony állatok, a reproduktív korban határozza meg az utat-ség vírusok. Sok esetben az egyetlen újszülött Ms-votnye érzékenyek egy adott vírus (például szopós egér a Coxsackie vírus). Az eljárás előnye, termesztése obligát intracelluláris paraziták Or-organizmusok laboratóriumi állatokon át a másik pedig egy kosár-Možnosti kiválasztása olyan vírusok, amelyek rosszul reprodutsi ruyutsya sejttenyészetben vagy embrió. A hátrányok közé tartozik a nagy valószínűséggel a szennyeződés a test állatok dopytnyh idegen vírusok és mycoplasma és a szükséges utólagos szennyeződés a kultúra ragasztó-áram szerezni tiszta tenyészete a vírus Uwe-lichivaet kutatás szempontjából.
vírusfajták módszerekkel. Annak igazolására, a jelenléte alapján-vírus sejttenyészetben használva több módszer.
I. A reprodukciós (szaporodási) vírusok sejttenyészetben bírálják el tsitopatteskomu hatás (CPE), amely kimutatható mikroszkópos morfológiai a Menen sejtek.
a) Néhány ilyen sejtek elpusztulnak, és kibújt a falát. b) A vírusrészecskék során felszabaduló pusztulását bizonyos sejtek, fertőzött más, ami egy idő után is elpusztul. Ennek eredményeként, hanem a teljes láb sejtmonoréteget csak néhány kletoch nye szigetekre.
Karakter CPE által okozott különböző vírusok, nem ugyanaz. Amikor a reprodukció néhány vírus (paramiksoviru-si, herpeszvírusok) megfigyelt sejtfúzió alkotnak syncytiákat, egyéb (enterovírusok, reovírusok) - gyűrődés és a sejtek pusztulását, a harmadik (adenovírus) - a sejtek aggregációja. vírust CPE értékelték dinamikája, látszó kultúra sejteket mikroszkóp alatt különböző időpontokban a fertőzés után a vírust tartalmazó anyagot. Nem-, hogy a vírusok (enterovírusok, herpeszvírusok) ok CPE 1-2 napig, mások - egy későbbi időpontban (4 ^ -6 napon). CPD Character kimutatására alkalmazott vírusok (kijelző) és az indikatív azonosító, azaz, op-meghatározottsága a faj.
Egyes vírusok is kimutatható, és amely a felvételen alkotnak a sejtmagban vagy a fertőzött sejtek citoplazmájában. Különböző formában zárványok, és a mérettartományban 0,25-25 mikron. Ezek olyan helyek, ahol a vírus részecskék és azonosítani lehet prep perces preparáltunk a fertőzött szövetet, és megfestettük fluorokrómokkal. Az utóbbi esetben is használnak egy fluoreszcens mikroszkóp.
Szennyezett sejtek morfológiája tanulmányok egy speciális inverz mikroszkóp, a co-torogo segédfény a tetején, és lencsék - aljáról a színpadra. Egy ilyen készülékkel lehetséges, hogy értékelje a sejtek morfológiája növekszik, mint egy egyrétegű felületén a tenyészet tartóedényt. Kie morfológiai változások a sejtek által érzékelt cisz-mikroszkóposan betartása kultúra lencse 8x vagy 40x. Ha összehasonlítjuk a sejt monoréteg a vírussal fertőzött, hogy a nem fertőzött sejtek a kontroll mintában teljes vagy szigetsejtek sejtpusztulás tartályból vagy egyéb változások jellemzik a vírus CPE. A részletesebb tanulmányozása CPE a tenyészet tartóedényt helyezzük fedőlemezt, amelyen a monoréteg kialakítására. Ezt követően az üveg eltávolítjuk, a fertőzött sejteket fixáltuk és melléktermékek elő mikroszkopikus hatóanyag, amelyek a fluorokróm festés, stb), és tanulmányozzák a bemerítési módszerrel.
vírus CPE is ki lehet mutatni a „színes minta”: metabolikusan aktív sejtek a kultúra az élet kiválasztó savas ételek, kötődik, akkor módosítsa az indikátor színe jelen a táptalaj. Ha a szaporodás a vírus sejtek elvesztik azt a képességüket bontják, és meghal, így színező környezet nem változik az idővel.
II. A reakció gemadsorbtsii használható, hogy jelezze GEMAG-glyutiniruyuschih vírusok. A reakciót képességén alapul a sejtfelszíni, amelyek reprodukálható ilyen vírusok adszorbeálni eritrociták. Ahhoz, hogy a kar gemad reakció-szorpciós a kultúra sejtek vírusokkal fertőzött, eritrociták szuszpenziót adunk hozzá, és miután egy bizonyos érintkezési idő zal-Ki mossuk izotóniás nátrium-klorid-oldattal. A sejtek felszínén vírusokkal fertőzött marad beragadt-Chiyah vörösvértestek.
III. A reakció hemagglutinációs (DSA) használják obna-servation hemagglutináló vírusok tenyésztő folyadékban vagy fertőzött kultúra sejtek vagy magzatvízben chorioallantois csirkeembrió. Hemagglutinálást - „kötés” a vörösvérsejtek különböző állatfajok (csirke, liba, tengerimalac) - vírus okozta tartalmazó hemagglutinin borítékot. Beállításához a reakció gemagglyuti-nemzet a vizsgálati anyag szuszpenziójához adjuk a vörösvértestek. A vírusok jelenlétét agglutinálja eritrociták.
3, stb A titer Niemann-WGA maximális hígítás, melyen hemagglutinációs figyelhető (++). Titer DSA-aktivitását ismertetik a vírus, és használjuk a készítményben a HI.
A kvantitatív kimutatására virális részecskék-polzujut titrálási módszerekkel. A vírustitert lehet meghatározni hemagglutináció 10-szeres hígításban cul-pozitív egész közepes vagy anyagot a csirke embrió, vagy CPE sejttenyészetben. Az utóbbi esetben, a tenyészet sejteket megfertőzzük 10-szeres hígítását tartalmazó anyag egy vírus. Miután egy 6-7 napos inkubációs a böngészés jelenlétére CPE. Mert vírustiterszint figyelembe a legnagyobb hígítás, CPE 50% -a fertőzött kul-kör. A vírustitert fejezzük citopátiás (fertőző) dózisok (ID5 on)
-A pontosabb kvantitatív módszer NYM számviteli osztály-CIÓ virális részecskék egy módszer Xia plakkok. sejttenyészet beoltott vírussal, és a fedél hang Kim agarrétegen. Miután a-kubirovaniya növények Techa-set több napig agar feiüietszakasz jelennek megvilágította megakadályozására-eloszlatott formában (plakkok) olyan területek az elpusztult sejtek a teljesen-prefektúra egyrétegű sejttenyészet. Mindegyik plakk képződik szaporodását VEE rétegű részecske és tisztán látható, mint a kör keresztmetszetű fény a piros háttér festett sejtek neutrálvörös in vivo. A titer a vírus, ez a set-NE Todd, kifejezi a plakk-képző egység (PFU) 1 ml. Méret, morfológiája és időzítése plakkok Különböző chayut-nem csak a különböző fajok a vírusok, hanem az egyes törzsek ugyanazon faj. Ezek a jelek a kiválasztásához alkalmazott törzsek és az előállítását az úgynevezett tiszta-Mykh vírusok vonalak.