Mi a Western blot analízis módszer, Western blot (Western blot) - bialexa

Mi a Western blot?

protein azonosítása komplex keverékek vagy kivonatok különböző szövetek egy gyakran felmerülő problémákat. Egy eszköz, mint például egy specifikus antitest képes meghatározni a célfehérje minimális időt és költségeket.

A Western-blot-eljárással (Western-blot) az első lépcsőben egy keveréke proteineket elektroforézissel választottuk el a jelenlétében nátrium-dodecil-szulfát (SDS), majd átvittük egy nitro-cellulóz-membránra elektroblottolással. Ennek lényege eljárás abban a tényben rejlik, hogy a gélből az elektroforézis után nitrocellulóz membránra között elhelyezett réteg szűrőpapírt. Összeszerelt így „szendvics” kerül egy elektromos mező, így komplexek fehérje-SDS gél lemezeket mozgatni keresztben és immobilizált (eredményeként a nem-specifikus adszorpció) felületén a nitrocellulóz membránt.

A kötő fehérje-SDS komplexet a nitro-cellulóz membrán részt főleg kényszeríteni elektromos jellegű, és ez a reakció egy több ponton, és vezet a „terjed” fehérjék a membrán felületén. Így, miután az elektro megkapjuk a nitrocellulóz replika a gél a fehérjék található, ugyanúgy, mint a poliakrilamid-gél.

Az SDS - elektroforézissel, elektromigráció és adszorpciós fehérjék a gélről nitrocellulóz membránra fehérje harmadlagos konformáció jelentősen megváltozott, ha egyáltalán helyes beszélni a létezését harmadlagos szerkezetének egy olyan fehérjét, miután ilyen súlyos feldolgozás. Ezért, az immunkémiai vizsgálat kimutatási fehérje általában csak használják mono- vagy poliklonális antitestek specifikus lineáris része a fehérje-molekula. Specifikus antitestek konformációs epitópok (vagy részletekben, amely alegységek közötti kapcsolatok) általában nem alkalmasak az eljárás Western-blot.

Miután fehérjét transzfer membrán egymás inkubáltuk specifikus antitestek a vizsgált fehérje, majd másodlagos antitestekkel specifikus Fc-fragmensek egy primer antitest, valamely enzimmel konjugált (vagy bármely más) kulcsszó (ábra. 1 A). Abban az esetben, ha egy címke van konjugálva közvetlenül a primer, specifikus a tesztantigénhez antitestek, szekunder antitestek nem szükséges (1. B). A képződött helyett a vizsgált fehérje lokalizációs immunkomplexek „nyilvánvaló” egy kromogén szubsztráttal (attól függően, hogy a címke típus).

Az érzékenység és specifikusság az eljárás nagymértékben függ, hogy milyen a használt antitestek a kutatásban. A használt antitest kell speciális egyedi, jellegzetes csak a teszt protein aminosav-szekvenciát. Ellenkező esetben, lehetséges kölcsönhatás (különösen abban az esetben a fehérje kivonatok durva) antitestek több fehérjemolekulák, ami viszont kialakulásához vezet a többszörös membrán csíkok festettük. Azonosítása a vizsgált fehérje ilyen esetben, hogy gyakran nehéz, sőt lehetetlen.

Egy másik fontos tényező, hogy tartsa szem előtt, amikor kiválasztják antitest affinitás. Minél nagyobb az affinitása a használt antitest, a világosabb és a tisztább megfestett fehérjét sávok, annál nagyobb az a módszer érzékenysége. Ha a nagy affinitású antitestek lehetséges elérni érzékenysége 1 ng, vagy még magasabb.

Ahhoz, hogy láthatóvá tegyük a kölcsönhatás eredményeként társított membrán antigén és ellenanyag használt konjugált másodlagos antitestet szerekkel tud adni egy bizonyos jelet bizonyos körülmények között. Általában, mint egy ilyen hatóanyag egy enzim (peroxidáz vagy foszfatáz), amely a reakció termék egy színt, és esik a membránon, mint egy oldhatatlan csapadékot. Szintén ez a módszer, akkor fluoreszcens jelzések.

Ábra. 1. ábra a vizsgált fehérje immunhisztokémiai festés: A - egy szekunder ellenanyagot egy enzimmel konjugáljuk, címke; B - az elsődleges antitest közvetlenül konjugált enzim jelöléssel láthatjuk.

I. eljárás a gél előállítására és a membrán fehérjék és elektromigráció

A poliakrilamid gél elektroforézis után helyeztünk egy tálcát egy blotting puffert (25 mM Tris, pH = 8,3, 192 mM glicin, 10% etanol). Két szűrőpapírt, vágja, hogy az alak a kazettát és áztatott blot puffer blot helyeztünk, hogy része a kazetta, hogy néz az anód. Ezután szűrőpapírra helyezzük előáztatott a fenti pufferrel nitrocellulóz membránra, ügyelve arra, hogy a membrán és a papír nem voltak légbuborékok. Ezt követően a membránt kell alaposan fel a gélt, ismét különös figyelmet arra, hogy a légbuborékok a gél és a membrán. Befejezése a kialakulását két réteg szendvics nedvesített szűrőpapírra helyezzük a a gél felületén (ábra. 2). A kapott szendvics van szorítva a kazettát, és helyezzük elektródák között úgy, hogy a membrán néz az anód.

Ábra. 2. reakcióvázlat elektrotranszfer fehérjék a membránhoz.

II. elektromig

Elektrotranszfere proteinek nitrocellulóz membránra végeztük tartalmazó pufferben 25 mM Tris, pH = 8,3, 192 mM glicin, 10% etanolban 30-50 percen át állandó feszültség 100 V. A elektrotranszport idő függ a méret a hordozható fehérjék több fehérjét mennyi időt vesz igénybe, hogy az elektro. Minősége elektromigráció és helyét a protein sávok értékeltük festéssel a nitrocellulóz membránra oldattal 0,3% Ponceau S 1% -os ecetsavban. Mielőtt immunhisztokémiai festést a membránt kell mosni néhányszor gyengén lúgos vizes Trisz, hogy eltávolítsuk a nem kötött festéket fehérjékkel.

III. Immunkémiai festési fehérjék immobilizált nitrocellulóz membránra

Blokkolásához aspecifikus kötődését antitestek helyeken a membránt inkubáltuk állandó keverés közben szobahőmérsékleten 30 percig PBST-vel (jobb zár lehet használni PBST oldattal, amely 10% fölözött tejet). Blokkolás után a membránokat egy órán át szobahőmérsékleten keverjük, és állandó keverés közben PBST, amely 1-10 mikrogramm / ml specifikus antitestek. A optimális koncentrációja a kiválasztott ellenanyag empirikusan, és függ a affinitását kölcsönhatás antitestek antigénnel. Az inkubálás után a membránt leöblítjük 5 alkalommal PBST-vel és át az oldatot a szekunder antitest torma peroxidázhoz konjugált. Konjugátum Hígítás általában a gyártó által meghatározott a csomagoláson, vagy a kutató kiválasztott empirikusan. Az oldatot, a szekunder antitest a membránt 1 órán állandó keverés közben.

Alapos mosás után (legalább 5-6-szor változtatni puffer) PBST a membrán átvisszük egy kromogén szubsztrát oldatot, mely 3 mg diaminobenzidin (DAB) és 10 ul 30% -os hidrogén-peroxid 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH = 7,6. Az inkubálást végeztük keverés közben 5-10 percig. Membrán inkubáció után a hordozóval kell öblíteni PBSTvel, száraz, áztatott szűrőpapír és azonnal, hogy az elektronikus másolatot is, színes szkennelés. Ha a membrán teljesen gyógyítható, festett sápadt fehérje sávok, és a kép, kevésbé fényes és éles.

Megjegyzés: DAB mérgező és karcinogén hatást. Bízza csak gumikesztyűt!