DNS izolálása proteináz K
DNS izolálása proteináz K
A proteináz K-t oldunk liofilizáljuk steril desztillált vízben koncentrációban 20 mg / ml, szétosztottuk azonos mennyiségekre, és tároljuk -20 0C.
2.Nasyschenny pufferolt fenollal
A legtöbb esetben, nagy tisztaságú fenolt lehet használni anélkül, hogy további desztillációval.
Fenol megolvasztunk 65 ° C jelenlétében azonos térfogatú 0,5 M Tris-HCl, pH = 8,0, amely 0,2% 8-hidroxi-kinolin és 0,2% 2-merkapto-etanol (2-ME). Amikor a fenol teljesen megolvadt, az elegyet alaposan keverjük, a vizes fázist összegyűjtjük, és kétszer extraháljuk fenollal, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8,0, amely 0,2% 2-ME. Miután a vizes fázis ne a eltávolítjuk az utolsó extrakciós, és hagyja egy edényben fenollal. Ebben a formában telített fenol tárolható 4 ° C-on 1 hónapig
3. kloroform: izoamil-alkohol (24: 1, v / v)
4. TE pufferben: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 8,0
1. Készítsünk mintákat.
2. Adjunk minden minta, 50 ul proteináz K oldatot (20 mg / ml), és alaposan összekevertük.
3.dobavlyayut hogy minden egyes mintából 250 ul szarkozil oldatot keverjük alaposan és gondosan.
4. Centrifuga mintákat 3500 30 másodpercig.
5.Inkubiruyut mintákat 50 0C-on 5 órán át. A kényelem kedvéért, az inkubálást végezhetjük egy éjszakán át (16 óra).
6.dobavlyayut minden egyes mintához 10 ml telített fenollal pufferrel, alaposan elegyítjük, amíg homogén emulziót.
7. Folytatás extrakciót keverés közben szobahőmérsékleten 5 percig.
8. Centrifuga 3500 1 percig.
9. Adjunk hozzá 10 ml kloroform: izoamil-alkohol extrakcióval, és még 5 percig folytatjuk.
10. elválasztjuk a vizes és a szerves fázisokat centrifugálással 3500 6 percig szobahőmérsékleten.
11. Transzfer a viszkózus vizes fázist egy új csőbe egy széles kaliberű pipettával, és ismételje extraháljuk kloroform: izoamil-alkohol egyszer vagy kétszer (amíg az interfázis tiszta).
12.Dobavlyayut hogy a vizes fázis, két térfogat etanolt, alaposan megkeverjük, és óvatosan. A DNS-csapadék képződik közvetlenül a keverés után.
13. Cobiralas DNS csapadékot centrifugálással 3500 5 percig.
14. A felülúszót, és a DNS-t mossuk, 20 ml 70% -os alkohollal.
15. Mossuk DNS 1 ml 70% -os alkohollal, és a DNS-t átvisszük egy mikrocentrifuga csőbe.
16.Osazhdayut DNS centrifugálással 3500 1 percig, és a felülúszót összegyűjtöttük.
17. A DNS-t vákuumban szárítjuk 2,5 percig.
18. A DNS-t TE-ben feloldjuk, hogy koncentrációja körülbelül 1 mg / ml